Антиангиогенная терапия при кератопластике высокого риска

Пересадка роговицы выполняется уже более 100 лет и считается одной из самых успешных операций в трансплантологии. По данным ряда исследователей, в группе кератопластики низкого риска даже без применения HLA-типирования и системной иммуносупрессии прозрачное приживление трансплантата достигается в 90% случаев. Однако частота отторжения трансплантата может повышаться до 40—70% в случаях кератопластики высокого риска (например, при наличии реакции отторжения в анамнезе или помещении трансплантата в васкуляризированное ложе реципиента) [1—3].

При нормальном гомеостазе роговица находится в условиях, обеспечивающих ее иммунную и ангиогенную привилегированность. Дисбаланс между провоспалительными, ангиогенными и лимфангиогенными медиаторами может приводить к стимуляции ангиогенеза. Врастание новообразованных сосудов в роговицу приводит к потере ее иммунной привилегированности, повышая риск развития иммунного конфликта [1, 2, 4]. Более 50% случаев возникновения реакции отторжения роговичного трансплантата отмечается у пациентов группы высокого риска с предсуществующей неоваскуляризацией [5].

Влияние подавления неоваскуляризации роговицы (НВР) на процессы приживления трансплантата изучается практически с момента внедрения кератопластики в широкую клиническую практику. С целью профилактики НВР и борьбы с ней традиционно применялись глюкокортикостероиды и нестероидные противовоспалительные средства. Однако, помимо того что существует широкий спектр нежелательных побочных эффектов [2], зачастую их антиангиогенное действие оказывается недостаточным, что заставляет искать новые пути решения данной проблемы [3, 6].

Для лечения НВР с различной степенью успеха использовались разнообразные методы деструкции новообразованных сосудов: аргоновая лазеркоагуляция, фотодинамическая терапия с применением фотосенсибилизаторов, тонкоигольная диатермокоагуляция, криодеструкция и бета-терапия. Эти методы направлены на окклюзию уже имеющихся новообразованных сосудов; не являясь специфическими и воздействующими на этиологию заболевания, они могут сами спровоцировать повышение секреции проангиогенных факторов и, как следствие, вызвать рецидивы неоваскуляризации [3, 6].

В настоящее время ключевым медиатором ангиогенеза признан фактор роста эндотелия сосудов (VEGF — Vascular Endothelial growth factor). Состоящий из пяти изоформ, VEGF стимулирует отдельные этапы нормального роста сосудов, включая индуцирование гемангиогенеза и лимфангиогенеза, пролиферацию эндотелиальных клеток сосудов, повышенный воспалительный ответ, протеолитическую активность и повышенную проницаемость сосудов. Антагонисты VEGF разрывают эти пути, блокируя взаимодействие между VEGF и его рецептором [7, 8].

Экспериментальная апробация применения анти-VEGF-препаратов в лечении НВР подтвердила их клиническую эффективность, что проявлялось в снижении калибра и количества сосудов, уменьшении зоны инвазии новообразованных сосудов в роговицу [5, 7—11].

Следует отметить, что использование ингибиторов VEGF направлено главным образом на микроциркуляторное звено новообразованной сосудистой сети, в то время как в уже сформированных магистральных сосудах эффект сравнительно невысок [11]. В то же время эффективность лазеркоагуляции в случаях наличия единичных врастающих в роговицу новообразованных сосудов «стволового» типа может достигать 80% [3]. Однако при разветвленной неоваскулярной сети с наличием множественных мелких сосудов данная процедура технически сложно выполнима. В связи с этим представляется целесообразным дополнение лазеркоагуляции сформированных стволовых новообразованных сосудов роговицы, направленной на облитерацию их просвета, введением ингибитора ангиогенеза [12].

Цель исследования — провести анализ эффективности и безопасности применения ингибитора VEGF самостоятельно и в комбинации с лазеркоагуляцией врастающих сосудов перед кератопластикой у пациентов с НВР.

В исследование вошло 56 пациентов (56 глаз) с помутнениями роговицы различной этиологии, осложненными НВР (сосудистыми бельмами 3—5-й категории по классификации Филатова—Бушмича) (см. таблицу). Средняя максимально корригированная острота зрения (МКОЗ) до операции составила 0,05±0,62 (0,005—0,33). Средний возраст пациентов — 51,1±13,6 года (от 18 до 76 лет).

Распределение больных в зависимости от этиологического процесса и степени выраженности НВР, n (%)

Все пациенты были разделены на три группы. В 1-ю группу вошли 27 пациентов с диффузной неоваскуляризацией роговицы, которым проводилась антиангиогенная терапия анти-VEGF-препаратом, во 2-ю — 14 пациентов с неоваскуляризацией стволового типа, которым перед кератопластикой проводили лазеркоагуляцию магистральных сосудов роговицы, комбинированную с субконъюнктивальным введением анти-VEGF-препарата. Третью, контрольную, группу составили 15 пациентов с НВР как диффузного, так и стволового типа, не получавшие антиангиогенную терапию.

Общее офтальмологическое обследование проводили всем 56 пациентам до операции, а также через 1, 3, 6, 12 мес и ежегодно после СКП. Помимо стандартного офтальмологического обследования для изучения прижизненной морфологии роговицы проводили конфокальную микроскопию (КМ) роговицы с использованием конфокального микроскопа Heidelberg Retinal Tomographer HRT-III (Heidelberg Engineering, Германия) при помощи роговичной насадки RCM, а также фоторегистрацию переднего сегмента глаза при помощи цифровой камеры (DC-3, Topcon, Япония).

Степень НВР оценивали по шкале В.В. Войно-Ясенецкого в баллах от 1 до 5 [13].

Всем пациентам была выполнена сквозная кератопластика по стандартной методике. Для трансплантации роговицы использовались консервированные в среде Борзенка—Мороз корнеосклеральные лоскуты, полученные из сертифицированного глазного банка. Предоперационная плотность эндотелиальных клеток доноров составляла 2481±301 кл/мм². Диаметр кератотрансплантата варьировал от 7,5 до 9 мм. Трансплантат фиксировали непрерывным швом (нейлон 10/0).

После операции все пациенты получали местную иммуносупрессивную терапию с использованием стероидов в виде инстилляций и параокулярных инъекций, а также антисептическую и слезозаместительную терапию. За 1—7 дней до хирургического вмешательства субконъюнктивально в зоне, наиболее близкой к питающим сосудам, пациентам 1-й и 2-й групп вводился антиангиогенный препарат афлиберцепт в дозе 2 мг. Пациентам 2-й группы после инъекции анти-VEGF-препарата проводили лазеркоагуляцию врастающих в роговицу сосудов.

Лазеркоагуляция сосудов роговицы проводилась под местной инстилляционной анестезией микроимпульсным лазером на системе Novus Varia (LUMENIS, США) с длиной волны 532 нм и со следующими параметрами микроимпульсов: время —150 мс, мощность — 300—600 мВт, диаметр пятна — 100—200 мкм. Объем коагуляции составлял 50—150 аппликатов. Коагуляты наносились на сосуды стволового типа, преимущественно приводящего звена.

Работа проводилась в рамках программы научных исследований. Протоколы были одобрены этическим комитетом и утверждены ученым советом ФГБНУ «НИИГБ». У всех больных было получено письменное информированное согласие.

КМ выполнялась до начала терапии, на следующий день после инъекции анти-VEGF-препарата (пациентам 1-й и 2-й групп) и в сроки 3—12 мес после операции. Исследование проводили по стандартной методике.

На следующий день после начала антиангиогенной терапии у всех пациентов 1-й и 2-й групп нами фиксировались спазм и частичное запустевание более мелких сосудов. У пациентов 2-й группы тромбоз и отсутствие тока крови по отдельным сосудам мы наблюдали сразу после выполнения лазеркоагуляции сосудов роговицы.

Активация ангиогенеза после операции наблюдалась у 32 пациентов, в том числе в течение первого месяца — у 20 пациентов (у 8 (29%) пациентов первой группы, у 5 (35%) пациентов 2-й группы и у 7 (46%) пациентов 3-й группы), и проявлялась дилатацией существующих в ободке собственной роговицы и конъюнктиве реципиента сосудов, инвагинацией их стенок, формированием сосудистых «почек» и ростом новых сосудов. В таких случаях пациентам 1-й и 2-й групп продолжали антиангиогенную терапию.

Как правило, после повторного введения афлиберцепта, выполняемого вслед за кератопластикой, мы наблюдали сужение и прекращение роста новообразованных сосудов, а также полное запустевание отдельных сосудов (рис. 1). При возобновлении роста сосудов повторные инъекции проводились с интервалом 1 мес и более до достижения стабилизации ангиогенеза. Максимально было выполнено 4 инъекции. Следует отметить, что применение афлиберцепта в ранних фазах ангиогенеза (до 6 нед) приводило к более выраженному эффекту по сравнению с его действием на уже сформированные сосуды при введении до операции.

Рис. 1. Фотографии глаза пациента А.

а — реактивация неоангиогенеза через 3 нед после СКП; б — через 5 дней после субконъюнктивального введения препарата: сужение и регресс новообразованных сосудов, а также полное запустевание отдельных сосудов.

В 3-й (контрольной) группе рост сосудов начинался в ободке собственной роговицы, распространялся по ходу швов и далее в оптическую зону трансплантата.

НВР в срок 24 мес в среднем составила 2,2 балла у пациентов 1-й группы, 2,5 балла — во 2-й группе и 3,4 балла у пациентов 3-й группы.

На протяжении всего срока наблюдения (от 4 до 30 мес) нами было зарегистрировано 7 (23%) случаев реакции отторжения в 1-й группе, 5 (35%) — во 2-й и 9 (60%) — в группе контроля (рис. 2). Средняя МКОЗ у пациентов 1-й группы составила 0,39±0,06 (0,005—0,9), 2-й группы — 0,30±0,04 (0,005—0,7) и 3-й группы — 0,15±0,05 (0,005—0,5) (рис. 3). Полная эпителизация трансплантата была достигнута в срок от 6 до 12 дней, в 14 случаях для этого потребовалось усиление режима слезозаместительной терапии и назначение лечебной мягкой контактной линзы.

Рис. 2. Кривая выживаемости Каплана—Мейера.

Рис. 3. МКОЗ, достигнутая после операции.

КМ роговицы перед операцией и после хирургического вмешательства проводилась с целью оценки ультраструктурных изменений и клеточной морфологии роговицы, а также выявления присутствующих иммунных клеток (главным образом, клеток Лангерганса) и других признаков воспаления.

До операции у пациентов с помутнениями роговицы различной этиологии мы наблюдали гиперрефлективную стромальную рубцовую ткань со слабо различимыми ядрами кератоцитов. Плотность гиперрефлективного материала возрастала в зонах вокруг функционирующих сосудов. Дендритные клетки (ДК), или клетки Лангерганса, имели вид ярких корпускулярных частиц с древовидной морфологией и диаметром до 15 нм. Они выявлялись у всех пациентов, локализуясь в базальном эпителии и боуменовом слое. Количество и морфология дендритных клеток оценивались по степеням активности: 0-я степень соответствовала отсутствию ДК; 1-я степень — клетки без отростков; 2-я степень (маленькие отростки) — размер отростков меньше, чем максимальный диаметр тела клетки; 3-я степень — длина отростков превосходит максимальный диаметр тела клетки [14]. Преимущественно выявлялись клетки 2-й степени, в среднем степень активности ДК у пациентов перед проведением кератопластики составила 2,2.

Нервные волокна в зоне помутнения имели абнормальную структуру и характеризовались снижением количества и плотности нервных волокон, которые имели извитую структуру.

Сосуды выявлялись у всех пациентов и визуализировались практически во всех слоях стромы роговицы на глубине от 60 до 570 нм, однако наиболее частой их локализацией являлись передние слои стромы. В просвете визуализировался ток форменных элементов крови, которые имели вид гиперрефлективных округлых телец (рис. 4).

Рис. 4. Изображение, полученное с помощью КМ.

В просвете сосуда визуализируются гиперрефлективные тельца — форменные элементы крови.

На следующий день после введения препарата, перед проведением кератопластики, как в 1-й, так и во 2-й группе мы наблюдали умеренное повышение рефлективности экстрацеллюлярного матрикса, что, предположительно, связано с влиянием антиангиогенного препарата на сосудистую стенку и повышенным ликеджем.

Клеточная морфология в слое базального эпителия, стромы и эндотелия оставалась неизмененной. На уровне поверхностных клеток эпителия отмечалось умеренное усиление десквамации с увеличением размеров клеток и активированными гиперрефлективными ядрами. У пациентов 2-й группы гиперрефлективность стромы была более выражена, также встречались запустевшие сосуды. Ток крови в них отсутствовал, визуализировался спавшийся просвет (рис. 5).

Рис. 5. Изображение, полученное с помощью КМ.

Состояние после субконъюнктивального введения препарата. Визуализируется спавшийся просвет сосудов роговицы.

В отдаленные сроки после хирургического вмешательства количество и плотность кератоцитов были снижены как в передних, так и в глубоких слоях стромы в разной степени, от субнормальных изменений вплоть до участков бесклеточной структуры.

Начальная реиннервация, представленная единичными извитыми нервными волокнами на периферии кератотрансплантата, была выявлена лишь у 7 пациентов в срок 9—12 мес (рис. 6). Регенерация нервных волокон носила случайный и неупорядоченный характер.

Рис. 6. Изображение, полученное с помощью КМ.

Периферическая реиннервация сквозного трансплантата роговицы через 9 мес после операции.

ДК присутствовали в умеренном количестве, при возникновении реакции отторжения трансплантата отмечалась тенденция к увеличению их числа, и они приобретали более зрелую морфологию (2—3-я степень). В контрольной группе отмечалось большее количество иммунных клеток Лангерганса, что свидетельствовало об относительном снижении иммунной сенсибилизации в основных группах.

В двух случаях (у пациентов 1-й и 3-й групп) было выявлено резкое увеличение количества ДК и степени их активности до 3-й, числа активированных кератоцитов и гиперрефлективных округлых телец, предшествующее появлению жалоб и клинических признаков реакции отторжения трансплантата.

Плотность эндотелиальных клеток через 6 мес после кератопластики в среднем составляла 2162± 339 кл/мм², через 1 год — 1797±355 кл/мм², через 2 года — 1603±369 кл/мм². Статистически достоверных различий плотности эндотелиальных клеток между исследуемыми группами не выявлено.

Известно, что под воздействием патологических факторов баланс антиангиогенных и проангиогенных цитокинов может нарушаться, приводя к патологическому врастанию сосудов в роговицу. Эти новообразованные сосуды имеют недостаточную структурную организацию, повышенную проницаемость и могут приводить к отеку, отложению липидов и помутнению роговицы. Кроме того, известно, что НВР, возникающая как до, так и после сквозной кератопластики, значительно повышает риск возникновения реакции отторжения трансплантата [2, 3, 5]. Следовательно, подавление ангиогенеза может быть перспективным подходом к повышению результатов оптико-реконструктивных операций.

В экспериментальной модели применения антиангиогенного препарата при сквозной кератопластике высокого риска с сопутствующей неоваскуляризацией M. Dastjerdi и соавт. [15] выявили, что его субконъюнктивальное введение способствовало приживлению трансплантата в 33% случаев, в то время как инстилляции препарата и отсутствие терапии в контрольной группе приводили к отторжению трансплантата в 100% случаев.

Первые клинические результаты использования анти-VEGF-препаратов, описанные в литературе, также свидетельствуют о том, что их применение с целью сохранения аваскулярности роговицы может являться приоритетным направлением в комплексе превентивных мер в борьбе за прозрачное приживление трансплантата [5, 16—19].

Однако на данный момент клинический опыт применения с этой целью ингибиторов VEGF ограничен малыми сроками наблюдений и недостаточным количеством клинического материала. Вопросы оптимальной дозировки и пути введения препарата (инстилляции, субконъюнктивальные и интрастромальные инъекции) также остаются открытыми.

Нами представлены предварительные результаты применения ингибитора VEGF и лазеркоагуляции в лечении НВР перед кератопластикой с целью повышения ее клинической эффективности (рис. 7). Критериями оценки служили результаты биомикроскопии и конфокальной микроскопии.

Рис. 7. Результаты применения анти-VEGF-препарата при кератопластике высокого риска у пациента Т.

а — сквозной кератотрансплантат с массивной неоваскуляризацией, сосуды стволового типа в виде двух аркад, расположенных циркулярно в зоне интерфейса ложе—трансплантат, МКОЗ = 0,3 эксцентрично; б — через 1 нед после лазеркоагуляции новообразованных сосудов и субконъюнктивального введения препарата (фотография сделана сразу после снятия непрерывного роговичного шва): значительное сокращение зоны неоваскуляризации в размерах, запустевание крупных сосудов, а также спазм и запустевание сосудов малого калибра, снижение интенсивности помутнения роговицы; в — через 1 год после рекератопластики: трансплантат прозрачен, васкуляризация трансплантата отсутствует, МКОЗ = 0,6.

Согласно полученным результатам, анти-VEGF-препарат, применяемый субконъюнктивально в дозе 2 мг как самостоятельно, так и в комбинации с лазеркоагуляцией новообразованных сосудов роговицы, является эффективным и безопасным методом подавления патологического ангиогенеза, способствующим повышению частоты прозрачного приживления трансплантата.

При рецидивах НВР введение антиангиогенного препарата приводило к редукции неоваскуляризации, стабилизации процессов ангиогенеза. Конфокальная микроскопия показала, что в основных группах отмечалось меньшее по сравнению с контрольной группой количество иммунных клеток Лангерганса, присутствие которых может быть ассоциировано с реакцией иммунного отторжения [20]. Мы не наблюдали клинически значимых побочных эффектов при проведении антиангиогенной терапии. Признаки эпителиопатии и замедленная эпителизация трансплантата отмечались как в основных, так и в контрольной группе, они купировались при усилении режима слезозаместительной терапии и назначении лечебной мягкой контактной линзы.

Механизмы, лежащие в основе возникновения реакции отторжения трансплантата, и механизмы воздействия антиангиогенной терапии на нее также требуют дальнейшего изучения.

НВР ассоциирована с повышенным уровнем провоспалительных медиаторов и клеток и тем самым способствует взаимодействию иммунной системы и донорских антигенов. Редукция неоваскуляризации может минимизировать иммуновоспалительный ответ после кератотрансплантации и повысить частоту случаев прозрачного приживления трансплантата [21, 22].

Использование комбинированного лечения с применением лазеркоагуляции и субконъюнктивального введения ингибитора VEGF позволяет добиться высоких результатов и у пациентов с васкуляризацией стволового типа.

1. Применение ингибиторов VEGF является перспективным этиопатогенетически обоснованным и безопасным методом борьбы с НВР, а также профилактики ее развития.

2. При НВР диффузного типа применение анти-VEGF-препарата с целью подавления предсуществующей неоваскуляризации, а также профилактики ангиогенеза в послеоперационном периоде способствует снижению сенсибилизации роговичной ткани и, как следствие, повышению частоты приживления кератотрансплантата.

3. Использование лазеркоагуляции, направленной на окклюзию новообразованных сосудов роговицы стволового типа, в комбинации с субконъюнктивальным введением ингибитора VEGF может обеспечить синергичное антиангиогенное воздействие.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Д.К., С.Т., С.М.

Сбор и обработка материала: С.М., Д.К., С.Т., Е.К., З.С.

Статистическая обработка: Д.К.

Написание текста: Д.К.

Редактирование: С.М., С.Т.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.