Воронин Г.В.

ФГБУ "НИИ глазных болезней" РАМН, Москва

Осипян Г.А.

ФГБУ "НИИ глазных болезней" РАМН, Москва

Труфанов С.В.

Учреждение Российской академии медицинских наук "НИИ глазных болезней РАМН", Москва

Будникова Е.А.

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт глазных болезней», ул. Россолимо, 11, А, Б, Москва, 119021, Российская Федерация

Розинова В.Н.

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт глазных болезней», ул. Россолимо, 11 А, Б, Москва, Российская Федерация, 119021

Суббот А.М.

ФГБУ "НИИ глазных болезней" РАМН, Москва

Макарова М.А.

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт глазных болезней», ул. Россолимо, 11, А, Б, Москва, 119021, Российская Федерация

Методы консервации донорских роговиц

Журнал: Вестник офтальмологии. 2018;134(5): 238-243

Просмотров : 18

Загрузок : 3

Как цитировать

Воронин Г. В., Осипян Г. А., Труфанов С. В., Будникова Е. А., Розинова В. Н., Суббот А. М., Макарова М. А. Методы консервации донорских роговиц. Вестник офтальмологии. 2018;134(5):238-243. https://doi.org/10.17116/oftalma2018134051238

Авторы:

Воронин Г.В.

ФГБУ "НИИ глазных болезней" РАМН, Москва

Все авторы (7)

В мире ежегодно осуществляется более 180 000 трансплантаций роговицы [1]. Очевидно, что спрос в этой области существенно превышает современные возможности доступа хирургов к нативной жизнеспособной роговичной ткани. Решать подобного рода проблемы призваны глазные банки. При этом оптимальная консервация кадаверного материала должна обеспечивать возможность регулярных поставок донорской ткани в лечебные учреждения для плановых и ургентных кератопластик различного вида.

Методы, используемые для консервации донорской роговицы, классифицируются в зависимости от продолжительности хранения как краткосрочные, среднесрочные, долгосрочные и с неограниченным сроком хранения. Это, соответственно, хранение во «влажной камере», гипотермический способ, метод органного культивирования и криоконсервация [2].

Метод хранения во «влажной камере»

Основоположником теории и практики консервации роговицы по праву считается В.П. Филатов, который в 1935 г. предложил метод сохранения глазного яблока во «влажной камере». При этом целый кадаверный глаз хранится в закрытой стерильной банке, наполненной насыщенным влажным воздухом при средней температуре 4 °C [3]. Если время между смертью донора и энуклеацией глаза находится в пределах от 4 до 6 ч, то донорский глаз, сохраненный данным методом, можно хранить и использовать для сквозной кератопластики (СКП) в течение 2 дней, при более длительном промежутке времени — для передней послойной кератопластики (ППКП). Чем короче срок хранения, тем лучше клинические результаты. Главным недостатком способа считается посмертный контакт эндотелиального слоя с измененной влагой передней камеры.

Консервация во «влажной камере» является самым простым и наиболее бюджетным из всех методов хранения. Это выгодно во многих ситуациях, особенно в развивающихся странах, где имеется огромная потребность в донорских роговицах, а дорогостоящие тканевые культуры с последующими бактериологическими тестами, как правило, недоступны. В этих случаях основные усилия должны быть направлены на забор максимального количества донорского материала в кратчайшие сроки после смерти донора. По этой причине кератопластика в таких регионах должна рассматриваться как экстренная операция, а консервация во «влажной камере» до сих пор может считаться методом выбора.

Время хранения глазного яблока во «влажной камере» ограничивается накоплением метаболических субстратов и продуктов обмена веществ в водянистой влаге, в частности лактата [4]. Поэтому следующим важным шагом развития способов хранения стали попытки консервации изолированной роговицы. Все нижеперечисленные методы в подавляющем большинстве подразумевают консервацию изолированного роговичного лоскута.

Гипотермический метод

Наиболее часто используемым методом консервации роговицы является гипотермический. Он широко применяется в Северной Америке, ведущих офтальмологических клиниках России, ряде развивающихся стран.

Принцип, лежащий в основе гипотермической консервации клеток, тканей и органов, базируется на замедлении метаболических процессов при охлаждении в соответствии с теорией Аррениуса. Однако такое замедление не приводит к тотальной остановке аутолитических процессов, и после определенного срока времени, варьирующего в зависимости от размера объекта (от нескольких часов для сердца до более 1 мес для эритроцитов), начинается деструкция ткани [5].

В 1960-х годах был предложен метод хранения роговичного лоскута в сыворотке крови. Вскоре после этого были разработаны синтетические растворы, ионный состав которых напоминал водянистую влагу передней камеры. Они содержали в своем составе хондроитина сульфат и аскорбиновую кислоту [6, 7]. В начале 1970-х годов гипотермический способ хранения корнеосклеральных дисков в растворе Мак-Кэри—Кауфмана (М—К-среде) стал методом выбора при трансплантации роговицы. В основе М—К-среды была культуральная клеточная среда М-199, содержащая 5% декстран 40, HEPES-буфер и антибиотики [8]. Хотя среда создавалась для хранения роговичного лоскута при температуре 4 °C на протяжении 7 дней, наилучший результат имели кератопластики, выполненные в пределах 4 сут после консервации. Даже такой, казалось бы, ограниченный срок хранения оказал большое положительное влияние на логистику поставок роговиц для трансплантации.

В дальнейшем, в 1985 г., H. Kaufman и соавторы усовершенствовали данную среду включением в ее состав осморегуляторных компонентов для снижения отека (K-Sol) [9]. В 1990 г. в России был предложен оригинальный состав отечественной среды для консервации роговицы (пропись Борзенка—Мороз) [10].

В настоящее время для среднесрочной консервации используют также и другие среды: Dexsol, Optisol, Eusol и пр., которые, в сущности, являются производными М—К-среды [11—14]. При заявленном возможном хранении роговицы в этих средах до 14 дней многие банки предпочитают не превышать срок хранения 7 сут.

Нормотермический метод

Нормотермический метод, или метод органного культивирования, позволяет длительно (до 35 дней) сохранять пригодные для СКП донорские роговицы.

Родоначальником метода стал D. Doughman [15, 16], который предложил хранить изолированную роговицу в питательной среде при температуре 34 °C в условиях термостата.

Наиболее распространенной средой для органной культивации является питательная среда Игла с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки. Большинство банков включают в состав среды пенициллин, стрептомицин и амфотерицин B. К альтернативным антибиотикам относятся биклин, тазоцин, амикин и нистатин. Не меняют среду во время хранения 40% банков, остальные проводят замену через каждые 1—2 нед. Концентрация декстрана, используемого для купирования отека стромы, во время хранения варьирует от 4 до 8%. Независимо от перечисленных различий результаты трансплантаций сходны. Роговицы обычно хранятся в подобных средах до 4 нед [17], но известны также случаи успешных кератопластик после 7-недельной консервации [18]. По сравнению с гипотермическим хранением, органная культура увеличивает шансы обнаружения бактерий и грибов, которые могут привести к послеоперационной инфекции, будучи вовремя невыявленными. Антибиотики в условиях более высокой температуры действуют эффективнее. Образец среды берется на микробиологическое исследование после 7 дней хранения. В дальнейшем такой скрининг проводится перед трансплантацией.

Обстоятельством, имеющим большое значение при проведении кератопластик высокого риска, является тот факт, что длительная органная консервация приводит к обеднению роговицы антигенпрезентирующими клетками, что снижает процент возможных иммунных реакций [19].

К недостаткам данного метода можно отнести необходимость постоянного экспертного технического наблюдения и относительную дороговизну.

Тем не менее метод широко распространен в странах Западной Европы [20, 21]. Из 66 глазных банков, включенных в каталог Европейской ассоциации глазных банков, 46 использовали органную культуру, 13 применяли гипотермическую консервацию, а 7 использовали оба метода [22].

Криотермический метод

Известным методом длительного хранения корнеосклеральных лоскутов с практически неограниченным сроком является криогенная консервация (сохранение ткани при минусовой температуре), поз-воляющая создать условия для холодового анабиоза [23, 24].

Первые опыты по консервации роговичной ткани при температуре ниже 0 °C провел французский ученый А. Magitot в 1911 г. Он консервировал роговицу при температуре –4°, –6 °С [25]. Эти опыты не увенчались успехом — роговица быстро теряла прозрачность.

В дальнейшем была исследована возможность хранения роговичной ткани в диапазоне от –3 до –20°C [26, 27]. Данный эксперимент выявил невысокий трансплантационный эффект сохраненного материала. В 1946 г. была сделана попытка консервации роговицы в условиях еще более низких температур — до –195 °С [28]. Клиническое применение криоконсервированных данным методом роговичных лоскутов также не увенчалось успехом, поскольку все произведенные СКП завершились помутнением пересаженного трансплантата, а в части случаев и его отторжением.

В дальнейшем были разработаны основные правила криоконсервации, такие как инкубация в крио-протекторных растворах для сохранения жизнеспособности консервированных клеточных элементов и соблюдение соответствующего режима замораживания—оттаивания.

Криоконсервация методом замораживания—оттаивания подразумевает наличие межклеточного раствора в замороженном состоянии (т.е. в кристаллической форме), но сводит к минимуму образование льда внутри клеток, поскольку формирование кристаллов приводит к разрушению клеточных мембран и как следствие — к гибели клетки. Этот эффект достигается охлаждением с контролируемой скоростью в присутствии криопротекторов в нетоксичных концентрациях [29].

В современной хирургии роговицы неуклонно возрастает доля послойных кератопластик, в том числе передних и межслойных, когда для успешного клинического результата не требуется сохранения высокой жизнеспособности донорских клеток, а имеет значение сохранение архитектоники — коллагеновой «матрицы», которая впоследствии заселяется собственными клетками реципиента. В таких случаях оптимальным материалом становится замороженный без криопротектора роговичный материал.

Иранские исследователи докладывают о проведении ими 3-летних клинических исследований с применением криоконсервированного без протектора донорского материала в составе целого глазного яблока. Продолжительность замораживания при температуре –70 °C варьировала от 5 дней до 7 мес. Оттаивание осуществляли поэтапно: сначала в течение 1 ч до 4 °C, затем еще 1 ч при комнатной температуре. Далее авторы выкраивали корнеосклеральные лоскуты. Пациентам с кератоконусом была выполнена глубокая передняя послойная кератопластика (ГППК), которая в подавляющем большинстве случаев завершилась прозрачным приживлением трансплантата [30].

Результаты успешного клинического применения криоконсервированной при температуре –20 °C роговичной ткани приводят ученые из Китая. Пациентам с краевой дегенерацией Терьена была выполнена периферическая ГППК. Период наблюдения составил около 2 лет. Большинство трансплантатов прижилось прозрачно [31].

Также ацеллюлярный материал, сохраненный без криопротектора, может быть методом выбора в ургентных случаях, когда необходимо сохранить глаз как орган и отложить оптическую реабилитацию на более поздний период.

Как сообщают корейские авторы, успешная ГППК была выполнена пациентке с угрозой перфорации роговицы. В качестве трансплантационного материала была использована донорская роговица, консервированная в среде Optisol-GS и сохраненная при температуре –70 °C в течение 4 нед. Через 6 мес после операции трансплантат оставался прозрачным [32]. Кроме того, их коллеги из Японии сообщают еще об одном благоприятном исходе ГППК, выполненной пациенту с десцеметоцеле и СКП в анамнезе. Авторы сохраняли роговицу в составе целого глазного яблока при температуре –80 °C в течение 3 мес. Далее глазное яблоко последовательно оттаивали при 20 °C в течение 4 ч, при 4 °C в течение 4 ч и затем при комнатной температуре в течение 2 ч, чтобы уменьшить повреждение ткани от перепада температур. После этого выкраивали корнеосклеральный лоскут и хранили до операции в растворе Optisol-GS [33].

Имеются сообщения об успешном случае проведения ургентной кератопластики пациенту с перфорацией роговицы, выполненной криоконсервированным роговичным лоскутом, полученным после проведения автоматизированной эндотелиальной кератопластики. Материал хранили при температуре –80 °C в течение 3 мес в растворе Optisol-GS. Хотя трансплантат прижился непрозрачно, структурная целостность роговицы была восстановлена [34].

Интересной областью применения криогенизированной роговичной ткани может быть «страховочное» сохранение материала, изъятого в ходе проведения операции ReLEx. Реимплантация данного материала дает возможность вернуть пациенту исходную толщину роговицы, а значит, и дооперационное значение рефракции, что очень важно при развитии пресбиопии или пострефракционной хирургической эктазии. Сохраненный и невостребованный материал также может быть использован для аллогенной трансплантации подходящему реципиенту. Данные по отработке методов хранения таких микролоскутов и их успешному клиническому применению приводят сингапурские исследователи [35]. Последние использовали для хранения лоскутов криопротектор диметилсульфоксид (ДМСО), однако логично предположить, что успех в данном случае не определяется напрямую сохранностью клеточных элементов, хотя, возможно, играет определенную роль.

Для осуществления СКП и задних кератопластик криогенизация материала должна в обязательном порядке включать обработку криопротекторным агентом.

Криопротекторы — это вещества, ограничивающие или устраняющие повреждающее действие замораживания и оттаивания на живые клетки и ткани. Они препятствуют формированию внутриклеточного льда и дегидратации путем образования комплексов с биокатионами и стабилизации конформации белков, что уменьшает повреждающий эффект гиперконцентрации солей.

Криопротекторы можно разделить на две категории:

1. Мембранопроникающие, которые проникают внутрь клетки и препятствуют формированию кристаллов льда за счет образования водородных связей с молекулами воды, — глицерин, ДМСО, пропиленгликоль, этиленгликоль.

2. Мембранонепроникающие, которые не проникают внутрь клеток, а оказывают свое действие путем снижения скорости образования кристаллов и защиты клетки от осмотических перепадов, — сахароза, трегалоза, фиколл, альбумин, поливинилпирролидон, декстран [36—39].

Исследования по криоконсервации роговичной ткани развивались в нескольких направлениях: изменение скорости охлаждения, варьирование температурного режима, оптимизация выбора криопротекторных растворов и их концентраций [40, 41].

Установлено, что только медленное охлаждение и быстрое размораживание сохраняют максимальную жизнеспособность эндотелия [42].

Из криопротекторов максимальную эффективность в плане сохранения жизнеспособности эндотелия показывают ДМСО и полиэтиленоксид с молекулярной массой 400 (ПЭО-400) [43, 44]. Однако количество выживающих эндотелиальных клеток часто все равно не достигает значений, необходимых для широкого внедрения этого метода в клиническую практику.

Во второй половине XX века производились интенсивные поиски оптимальных криопротекторов. Результаты экспериментальных и клинических исследований противоречивы [45—49]. Первоначальный оптимизм 60—70-х годов сменился скептицизмом, и на сегодняшний момент становится понятно, что крио-генизация донорской роговицы для СКП может быть успешной лишь при очень высоких «стартовых» значениях плотности эндотелиальных клеток (ПЭК) [50].

Перспективным может оказаться подход, при котором используется декстран в качестве мембранонепроникающего криопротектора. По данным М. Halberstadt и соавторов, после размораживания и недельного органного культивирования все слои роговицы были структурно сохранны, но ПЭК при этом составила 1300±360 кл/мм2 [51]. Необходимы дальнейшие экспериментально-клинические исследования, чтобы сделать вывод о результативности такого метода криогенизации.

Витрификация является альтернативным методом сохранения роговицы при минусовых температурах. В этом случае удается миновать ледообразования в образце в целом (внутри и вне клеток). Однако опасность для клеток эндотелия может возникать из-за длительного контакта с криопротекторами и приводить к токсическим реакциям [29]. Время, необходимое для отмывки от токсичного вещества в этом случае, остается слишком большим для того чтобы глазные банки приняли метод витрификации на вооружение [50, 52].

Заключение

В современной деятельности глазных банков основными методами хранения донорских корнеосклеральных лоскутов являются среднесрочный метод гипотермии и долгосрочный метод нормотермической консервации, которые обеспечивают адекватное сохранение роговичной ткани и ее эндотелиального слоя для успешных сквозных и послойных трансплантаций роговицы, а также позволяют осуществлять планомерные поставки кадаверных корнеосклеральных лоскутов из глазных банков в лечебные учреждения для плановых и экстренных реконструктивных вмешательств.

Возможно, непрекращающиеся работы в направлении оптимизации протоколов заморозки приведут к появлению достаточно эффективного способа длительного сохранения роговичного эндотелия. Однако на сегодняшний день сложность метода и значительное повреждение эндотелиальных клеток в процессе хранения ограничивают использование криоконсервированной роговицы для сквозных кератопластик, оставляя за криогенным хранением «нишу» материала для различных видов передних послойных и межслойных операций и ургентных вмешательств.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Труфанов Сергей Владимирович — д-р мед. наук, и.о. заведующего отделением патологии роговицы

e-mail: trufanov05@mail.ru

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail