Методы консервации донорских роговиц

Известным методом длительного хранения корнеосклеральных лоскутов с практически неограниченным сроком является криогенная консервация (сохранение ткани при минусовой температуре), поз-воляющая создать условия для холодового анабиоза [23, 24].

Первые опыты по консервации роговичной ткани при температуре ниже 0 °C провел французский ученый А. Magitot в 1911 г. Он консервировал роговицу при температуре –4°, –6 °С [25]. Эти опыты не увенчались успехом — роговица быстро теряла прозрачность.

В дальнейшем была исследована возможность хранения роговичной ткани в диапазоне от –3 до –20°C [26, 27]. Данный эксперимент выявил невысокий трансплантационный эффект сохраненного материала. В 1946 г. была сделана попытка консервации роговицы в условиях еще более низких температур — до –195 °С [28]. Клиническое применение криоконсервированных данным методом роговичных лоскутов также не увенчалось успехом, поскольку все произведенные СКП завершились помутнением пересаженного трансплантата, а в части случаев и его отторжением.

В дальнейшем были разработаны основные правила криоконсервации, такие как инкубация в крио-протекторных растворах для сохранения жизнеспособности консервированных клеточных элементов и соблюдение соответствующего режима замораживания—оттаивания.

Криоконсервация методом замораживания—оттаивания подразумевает наличие межклеточного раствора в замороженном состоянии (т.е. в кристаллической форме), но сводит к минимуму образование льда внутри клеток, поскольку формирование кристаллов приводит к разрушению клеточных мембран и как следствие — к гибели клетки. Этот эффект достигается охлаждением с контролируемой скоростью в присутствии криопротекторов в нетоксичных концентрациях [29].

В современной хирургии роговицы неуклонно возрастает доля послойных кератопластик, в том числе передних и межслойных, когда для успешного клинического результата не требуется сохранения высокой жизнеспособности донорских клеток, а имеет значение сохранение архитектоники — коллагеновой «матрицы», которая впоследствии заселяется собственными клетками реципиента. В таких случаях оптимальным материалом становится замороженный без криопротектора роговичный материал.

Иранские исследователи докладывают о проведении ими 3-летних клинических исследований с применением криоконсервированного без протектора донорского материала в составе целого глазного яблока. Продолжительность замораживания при температуре –70 °C варьировала от 5 дней до 7 мес. Оттаивание осуществляли поэтапно: сначала в течение 1 ч до 4 °C, затем еще 1 ч при комнатной температуре. Далее авторы выкраивали корнеосклеральные лоскуты. Пациентам с кератоконусом была выполнена глубокая передняя послойная кератопластика (ГППК), которая в подавляющем большинстве случаев завершилась прозрачным приживлением трансплантата [30].

Результаты успешного клинического применения криоконсервированной при температуре –20 °C роговичной ткани приводят ученые из Китая. Пациентам с краевой дегенерацией Терьена была выполнена периферическая ГППК. Период наблюдения составил около 2 лет. Большинство трансплантатов прижилось прозрачно [31].

Также ацеллюлярный материал, сохраненный без криопротектора, может быть методом выбора в ургентных случаях, когда необходимо сохранить глаз как орган и отложить оптическую реабилитацию на более поздний период.

Как сообщают корейские авторы, успешная ГППК была выполнена пациентке с угрозой перфорации роговицы. В качестве трансплантационного материала была использована донорская роговица, консервированная в среде Optisol-GS и сохраненная при температуре –70 °C в течение 4 нед. Через 6 мес после операции трансплантат оставался прозрачным [32]. Кроме того, их коллеги из Японии сообщают еще об одном благоприятном исходе ГППК, выполненной пациенту с десцеметоцеле и СКП в анамнезе. Авторы сохраняли роговицу в составе целого глазного яблока при температуре –80 °C в течение 3 мес. Далее глазное яблоко последовательно оттаивали при 20 °C в течение 4 ч, при 4 °C в течение 4 ч и затем при комнатной температуре в течение 2 ч, чтобы уменьшить повреждение ткани от перепада температур. После этого выкраивали корнеосклеральный лоскут и хранили до операции в растворе Optisol-GS [33].

Имеются сообщения об успешном случае проведения ургентной кератопластики пациенту с перфорацией роговицы, выполненной криоконсервированным роговичным лоскутом, полученным после проведения автоматизированной эндотелиальной кератопластики. Материал хранили при температуре –80 °C в течение 3 мес в растворе Optisol-GS. Хотя трансплантат прижился непрозрачно, структурная целостность роговицы была восстановлена [34].

Интересной областью применения криогенизированной роговичной ткани может быть «страховочное» сохранение материала, изъятого в ходе проведения операции ReLEx. Реимплантация данного материала дает возможность вернуть пациенту исходную толщину роговицы, а значит, и дооперационное значение рефракции, что очень важно при развитии пресбиопии или пострефракционной хирургической эктазии. Сохраненный и невостребованный материал также может быть использован для аллогенной трансплантации подходящему реципиенту. Данные по отработке методов хранения таких микролоскутов и их успешному клиническому применению приводят сингапурские исследователи [35]. Последние использовали для хранения лоскутов криопротектор диметилсульфоксид (ДМСО), однако логично предположить, что успех в данном случае не определяется напрямую сохранностью клеточных элементов, хотя, возможно, играет определенную роль.

Для осуществления СКП и задних кератопластик криогенизация материала должна в обязательном порядке включать обработку криопротекторным агентом.

Криопротекторы — это вещества, ограничивающие или устраняющие повреждающее действие замораживания и оттаивания на живые клетки и ткани. Они препятствуют формированию внутриклеточного льда и дегидратации путем образования комплексов с биокатионами и стабилизации конформации белков, что уменьшает повреждающий эффект гиперконцентрации солей.

Криопротекторы можно разделить на две категории:

1. Мембранопроникающие, которые проникают внутрь клетки и препятствуют формированию кристаллов льда за счет образования водородных связей с молекулами воды, — глицерин, ДМСО, пропиленгликоль, этиленгликоль.

2. Мембранонепроникающие, которые не проникают внутрь клеток, а оказывают свое действие путем снижения скорости образования кристаллов и защиты клетки от осмотических перепадов, — сахароза, трегалоза, фиколл, альбумин, поливинилпирролидон, декстран [36—39].

Исследования по криоконсервации роговичной ткани развивались в нескольких направлениях: изменение скорости охлаждения, варьирование температурного режима, оптимизация выбора криопротекторных растворов и их концентраций [40, 41].

Установлено, что только медленное охлаждение и быстрое размораживание сохраняют максимальную жизнеспособность эндотелия [42].

Из криопротекторов максимальную эффективность в плане сохранения жизнеспособности эндотелия показывают ДМСО и полиэтиленоксид с молекулярной массой 400 (ПЭО-400) [43, 44]. Однако количество выживающих эндотелиальных клеток часто все равно не достигает значений, необходимых для широкого внедрения этого метода в клиническую практику.

Во второй половине XX века производились интенсивные поиски оптимальных криопротекторов. Результаты экспериментальных и клинических исследований противоречивы [45—49]. Первоначальный оптимизм 60—70-х годов сменился скептицизмом, и на сегодняшний момент становится понятно, что крио-генизация донорской роговицы для СКП может быть успешной лишь при очень высоких «стартовых» значениях плотности эндотелиальных клеток (ПЭК) [50].

Перспективным может оказаться подход, при котором используется декстран в качестве мембранонепроникающего криопротектора. По данным М. Halberstadt и соавторов, после размораживания и недельного органного культивирования все слои роговицы были структурно сохранны, но ПЭК при этом составила 1300±360 кл/мм² [51]. Необходимы дальнейшие экспериментально-клинические исследования, чтобы сделать вывод о результативности такого метода криогенизации.

Витрификация является альтернативным методом сохранения роговицы при минусовых температурах. В этом случае удается миновать ледообразования в образце в целом (внутри и вне клеток). Однако опасность для клеток эндотелия может возникать из-за длительного контакта с криопротекторами и приводить к токсическим реакциям [29]. Время, необходимое для отмывки от токсичного вещества в этом случае, остается слишком большим для того чтобы глазные банки приняли метод витрификации на вооружение [50, 52].