Щуко А.Г.

ГОУ ВПО "Иркутский государственный медицинский университет"

Злобин И.В.

Иркутский филиал ФГБУ "МНТК "Микрохирургия глаза" им. акад. С.Н. Федорова

Юрьева Т.Н.

Иркутский филиал ФГБУ "МНТК "Микрохирургия глаза" им. акад. С.Н. Федорова

Останин А.А.

ФГБНУ «НИИ фундаментальной и клинической иммунологии», Ядринцевская ул., 14, Новосибирск, Российская Федерация, 630099

Черных Е.Р.

ФГБНУ «НИИ фундаментальной и клинической иммунологии», Ядринцевская ул., 14, Новосибирск, Российская Федерация, 630099

Дисбаланс внутриглазных цитокинов при окклюзии вен сетчатки и его взаимосвязь с эффективностью антиангиогенной терапии

Журнал: Вестник офтальмологии. 2015;131(2): 50-58

Просмотров : 10

Загрузок :

Как цитировать

Щуко А. Г., Злобин И. В., Юрьева Т. Н., Останин А. А., Черных Е. Р. Дисбаланс внутриглазных цитокинов при окклюзии вен сетчатки и его взаимосвязь с эффективностью антиангиогенной терапии. Вестник офтальмологии. 2015;131(2):50-58. https://doi.org/10.17116/oftalma2015131250-58

Авторы:

Щуко А.Г.

ГОУ ВПО "Иркутский государственный медицинский университет"

Все авторы (5)

Окклюзия ретинальных вен является тяжелым, широко распространенным сосудистым заболеванием сетчатки, характеризующимся внутрисосудистой или внешней обструкцией, приводящей к формированию интраретинальных кровоизлияний, экссудации жидкости и ишемии различной степени. Такое поражение сосудов сопровождается каскадом клеточных и воспалительных реакций, что нарушает нормальное взаимодействие регуляторных механизмов в поврежденной ткани. Возникает дисбаланс воспалительных и ангиогенных цитокинов, который, вероятно, определяет морфологические и функциональные нарушения органа зрения [1, 2].

Цитокины (ЦК) представляют собой группу медиаторов, участвующих в регуляции защитных реакций организма в ответ на внедрение патогенов или нарушение целостности тканей. В первую очередь, ЦК регулируют развитие местных защитных реакций в тканях с участием различных типов клеток крови, эндотелия, соединительной ткани, глии [3]. Защита на местном уровне развивается путем формирования типичной воспалительной реакции с ее классическими проявлениями — отеком и нарушением функции.

В настоящее время известно более 100 различных ЦК [4]. По биологической активности их распределили на несколько групп (семейств), среди которых наиболее известны интерфероны (ИФН), факторы некроза опухолей (ФНО), различные семейства интерлейкинов (ИЛ), ростовых факторов, хемокины семейства Т-хелперных клонов и регулирующие функции лимфоцитов [5]. Свойства Ц.К. весьма многообразны: они индуцируют, регулируют и ограничивают воспаление, стимулируют рост, пролиферацию, дифференцировку клеток, метаболизм. Для них характерны универсальность, взаимозаменяемость и плейотропность, т. е. одни и те же ЦК могут взаимодействовать с рецепторами различных клеток, при этом ЦК со сходным строением могут оказывать противоположное биологическое действие, а разные в структурном отношении ЦК — вызывать одинаковый эффект [3]. При всем многообразии функций у конкретных медиаторов преобладают определенные свойства.

По функциональной активности ЦК можно упрощенно сгруппировать следующим образом:

1) провоспалительные ЦК (ИЛ-1β, -6, -8, -12, -15, ИФН-γ, ФНО-α и др.) и хемокины — моноцитарный хемоаттрактантный белок-1 (MХБ-1), ИЛ-8, хемокин, выделяемый Т-клетками при активации (RANTES). Первые активируют Т- и В-лимфоциты, стимулируют хемотаксис, фагоцитарную и цитотоксическую активность, вторые ответственны за трафик (хемотаксис) иммунокомпетентных клеток в очаг воспаления;

2) противовоспалительные ЦК: ИЛ-4, -10, -13, -17, рецепторный антагонист интерлейкина-1 (раИЛ-1) и др. Они ингибируют воспаление, угнетают синтез провоспалительных ЦК, стимулируют пролиферацию В-клеток, синтез иммуноглобулинов, антител, способствуют завершению острой фазы воспаления и формированию фиброза;

3) факторы роста: васкулярный эндотелиальный (ВЭФР), фибробластов (ФРФ), нервов (ФРН), тромбоцитарный (ТцФР), инсулиноподобный (ИПФР), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий (ГМ-КСФ), гранулоцитарный колониестимулирующий (Г-КСФ), трансформирующий (ТФР) и др. Активируют пролиферацию и дифференцировку клеток, участвуют в апоптозе и ангиогенезе, стимулируют «выживаемость» клеток.

Участие ЦК в иммунопатогенезе различных заболеваний не вызывает сомнений [6]. Раскрытие механизмов цитокиновой регуляции при патологии послужило толчком к внедрению в медицинскую практику новых методов цитокиновой (заместительной) и антицитокиновой терапии [7—9]. Офтальмология не стала исключением [10, 11]. Интерес к изучению тканевых и клеточных регуляторов в глазу возник относительно недавно. Так, первые исследования концентрации ЦК при увеитах относятся к началу 90-х годов ХХ века. Интересные данные были получены при оценке иммунного ответа после интраокулярной инъекции отдельных воспалительных ЦК и факторов роста в тканях энуклеированных глаз лабораторных животных [12, 13]. Многочисленные работы были посвящены исследованию воспалительной природы диабетических ретинопатии и макулярного отека, роли ВЭФР и воспалительных ЦК в патогенезе развития пролиферативной стадии [14—16]. Справедливо полагая, что обусловливающий снижение зрения макулярный отек имеет воспалительную природу, офтальмологи в противовоспалительной терапии стали применять кортикостероидный препарат триамцинолона ацетонида в интравитреальных инъекциях [17, 18]. Авторы отмечали положительный эффект, который выражался в редуцировании макулярного отека. Однако действие лекарства длилось недолго, а побочные эффекты препарата в виде вторичной стероидной глаукомы и катаракты заставили постепенно отказаться от его применения.

В настоящее время можно констатировать нарастающий интерес исследователей к изучению внутриглазного уровня (баланса) ЦК и раскрытию цитокиновых механизмов развития различных сосудистых заболеваний органа зрения, в том числе окклюзии вен сетчатки (ОВС).

Определенным прорывом в использовании антицитокиновой стратегии в современной офтальмологии стала разработка препаратов-ингибиторов ангиогенеза (анти-ВЭФР-антител, Avastin), эффективность которых доказана при различных сосудистых поражениях, включая ОВС [19].

Участие ВЭФР в патогенезе макулярного отека при ОВС изучено достаточно хорошо [2]. В настоящее время определено, что больные с ОВС характеризуются повышенным уровнем ВЭФР, при этом степень тяжести макулярного отека прямо коррелирует с уровнем ВЭФР и ИЛ-6 [2, 20]. Были выявлены также аналогичные взаимосвязи между уровнем ВЭФР, неоваскуляризацией радужки и сосудистой проницаемостью у пациентов с ишемической ОВС [21]. Очевидно, что чрезмерная сосудистая проницаемость, вызывающая макулярный отек, обусловлена повышенной секрецией ВЭФР. Однако при длительном существовании отек сетчатки способствует повреждению капилляров, поддержанию высокого уровня ретинальной ишемии, что в свою очередь стимулирует дальнейший выброс ВЭФР и воспалительных ЦК [1, 22]. Как известно, макрофаги и моноциты способны секретировать широкий спектр провоспалительных медиаторов, которые наряду с ВЭФР увеличивают сосудистую проницаемость. Кроме того, ИЛ-6 как один из важнейших индукторов острофазовых белков также может стимулировать повышенную секрецию ВЭФР [2, 23].

Несмотря на активное изучение роли ЦК в формировании и поддержании различных воспалительных и сосудистых реакций глаза, в настоящее время нет четких сведений об их количественном содержании в разные фазы постокклюзионных поражений сетчатки. Кроме того, отсутствуют данные об изменении концентрации цитокинов во внутриглазной влаге у пациентов с ОВС на фоне лечения анти-ВЭФР-антителами (ранибизумаб, Lucentis).

Цель исследования — оценить концентрацию внутриглазных цитокинов у больных с ОВС до и после проведения антиангиогенной терапии ранибизумабом, сопоставить полученные данные с клинической активностью заболевания и эффективностью лечения.

Материал и методы

Исследование проводилось в Иркутском филиале МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова совместно с сотрудниками НИИ фундаментальной и клинической иммунологии (Новосибирск). Протокол исследования был утвержден Локальным этическим комитетом ИФ МНТК М.Г. Информированное согласие было получено от всех пациентов.

Проведено офтальмологическое обследование 44 пациентов с ОВС в возрасте от 46 до 79 лет (средний возраст 60,7±7,5 года), среди которых 18 — с окклюзией центральной вены сетчатки (ОЦВС) и 26 — с окклюзией ветви вены сетчатки (ОВВС). Соотношение мужчин и женщин — 10:34. Контрольную группу составили 20 пациентов с начальной неосложненной катарактой с высокой корригированной остротой зрения, ориентированные на рефракционную операцию, в возрасте от 49 до 71 года (средний возраст 60±6,1 года), соотношение мужчин и женщин — 11:9.

Критерием включения в основную группу исследования пациентов был макулярный отек на фоне ОЦВС или окклюзии височной ветви вены сетчатки на сроках давности от 3 нед до 3 мес. Критерии исключения — неоваскулярные поражения сетчатки и радужки, вторичная глаукома, предшествующие хирургические или лазерные вмешательства.

Всем пациентам с ОВС в лечебных целях делали инъекции ранибизумаба в разовой дозе 0,5 мг. После обработки операционной поверхности глазного яблока, непосредственно перед инъекцией выполняли парацентез передней камеры глаза, камерную влагу в количестве 100 мкл забирали с помощью инсулинового шприца с иглой 27-gauge. Затем жидкость помещали в стерильную пробирку и отправляли в морозильную камеру (–80 °С) до лабораторного анализа. Сразу после забора материала выполняли инъекцию ранибизумаба по стандартной технологии. В дальнейшем, через 1 мес, у всех пациентов снова осуществляли забор внутриглазной жидкости перед повторной инъекцией ранибизумаба.

Забор образцов влаги передней камеры глаза в контрольной группе осуществляли идентичным способом однократно перед началом хирургической операции.

В целях выявления прогностических критериев эффективности анти-ВЭФР-терапии все пациенты были разделены на 2 группы с достаточным (1-я группа) и недостаточным (2-я) клиническим эффектом. Критериями достаточности эффекта явились: повышение остроты зрения более чем на 0,05 ед, уменьшение толщины сетчатки в центре макулярной зоны более чем в 2 раза, улучшение электроретинографических показателей (повышение амплитуды a-, b-волны и осцилляторных потенциалов) через 1 мес после однократной инъекции ранибизумаба. Критериями его недостаточности были: снижение остроты зрения, недостоверные изменения толщины сетчатки в макуле и данных электроретинографии. В 1-ю группу (30 пациентов) вошли 9 человек с ОЦВС и 21 — с ОВВС. 2-ю группу составили 14 человек, из них 9 — с поражением ствола центральной вены сетчатки и 5 — с окклюзией височных ветвей.

Лабораторное исследование. Для определения уровня ЦК в исследуемых образцах влаги передней камеры глаза использовался метод протеомного мультиплексного анализа. Концентрацию 27 ЦК человека: раИЛ-1, ИЛ-1β, -2, -4—10, -12p70, -13, -15, -17A, эотоксина, ФРФ основного, Г-КСФ, ГМ-КСФ, ИФН -γ, индуцирующего продукцию ИФН-γ белка-10 (ИБ-10), МХБ-1, макрофагальных белков воспаления 1α и 1β (MIP-1α, -1β), ТцФР BB, RANTES, ФНО-α, ВЭФР — оценивали с помощью метода проточной флюорометрии [24] на двухлучевом лазерном автоматизированном анализаторе (Bio-Plex Protein Assay System, «Bio-Rad», США) с использованием коммерческих тест-систем Human 27-Plex, в соответствии с инструкцией фирмы-производителя.

Офтальмологическое обследование включало стандартные методы диагностики (визометрия, офтальмоскопия), а также дополнительные исследования морфофункционального состояния сетчатки — оптическую когерентную томографию (Cirrus HD-OCT, «Carl Zeiss Meditec Inc.», США) [26], флюоресцентную ангиографию сетчатки (TRC-50DX, «Topcon», Япония), ультразвуковую допплерографию сосудов глаза (Voluson 730 Pro, «General Electric», США) [27], компьютерную периметрию (Twinfield, «Oculus», США) и электроретинографию (ЭРГ) (ЕР-1000 РС, «Tomey», Япония).

Статистическая обработка данных осуществлялась методами одномерной статистики с расчетами критериев Манна—Уитни и Уилкоксона. Кроме того, для выявления наиболее информативных признаков различия в исследуемых группах применялся дискриминантный анализ с определением F-критерия Фишера. Все расчеты производились с помощью программы Statistica 8.0 («Stat Soft Inc.», США).

Результаты и обсуждение

Сравнительный анализ содержания 27 ЦК во влаге передней камеры глаза пациентов основной и контрольной групп выявил у больных с ОВС статистически значимые изменения в уровне 11 Ц.К. По данным, представленным в табл. 1, видно, что исходно (до начала терапии ранибизумабом) у больных с ОВС регистрировалось увеличение концентрации ВЭФР, про- и противовоспалительных ЦК (ИЛ-6, -12 и ИЛ-10, -13 соответственно) и хемокинов (ИЛ-8, МХБ-1), при этом содержание раИЛ-1, ИЛ-9 и RANTES было достоверно ниже, чем в группе контроля. Следует подчеркнуть, что наиболее выраженные изменения в уровне исследуемых цитокинов отмечались в подгруппе больных с ОЦВС, тогда как у пациентов с ОВВС нарушения цитокинового профиля проявлялись в меньшей степени. Повышение концентрации ИЛ-15 было самым незначительным (на 70% при ОЦВС и на 39% при ОВВС), хотя и статистически достоверным.

Таблица 1. Концентрация цитокинов во влаге передней камеры глаза у пациентов в группах с ОВС и контроля до начала терапии ранибизумабом, M±SD

Исследование уровня ЦК во влаге передней камеры глаза пациентов с ОВС в динамике проводимой терапии (через 1 мес после введения ранибизумаба) выявило достоверное снижение концентрации практически всех исследуемых ЦК (табл. 2). Как и ожидалось, после инъекции анти-ВЭФР-препарата произошло наибольшее изменение концентрации ВЭФР: 27-кратное снижение в группе ОЦВС и 5-кратное у пациентов с ОВВС. Кроме того, регистрировалось снижение уровня про- и противовоспалительных ЦК (ИЛ-6, -12 и ИЛ-10, -13, -15 соответственно) и хемокинов (ИЛ-8, MCP-1). Интересно, что раИЛ-1 и ИЛ-9 у больных с ОВС, несмотря на исходно более низкую концентрацию, чем у лиц группы контроля, также продемонстрировали снижение в ответ на инъекцию ранибизумаба.

Таблица 2. Концентрация цитокинов во влаге передней камеры глаза у пациентов с ОВС в динамике проводимой терапии ранибизумабом, M±SD (Mmin—Mmax)

Необходимо отметить, что достаточный клинический эффект проводимой анти-ВЭФР-терапии в подгруппе больных с ОВВС был достигнут в 81% случаев (у 21 из 26 пациентов), тогда как у больных с ОЦВС эффективность терапии была достоверно ниже — 50% (9 из 18 пациентов).

Согласно результатам сравнительного анализа исходного офтальмологического статуса в подгруппах больных с ОВС, оппозитных по клиническому эффекту анти-ВЭФР-терапии (табл. 3), состояние пациентов с недостаточным клиническим эффектом характеризовалось более выраженным утолщением сетчатки как в зоне fovea, так и в перипапиллярной, депрессией амплитуд а-волны ЭРГ и осцилляторных потенциалов (ОП). И это позволило, согласно разработанным нами ранее критериям [25], констатировать и охарактеризовать глубину ишемического поражения нейроретины I—III степени:

Таблица 3. Исходный офтальмологический статус пациентов с ОВС с достаточным (+) и недостаточным (–) клиническим эффектом анти-ВЭФР-терапии, M±SD

— I степень (легкая): наличие небольшой зоны неперфузии макулы (менее 1 квадранта), снижение ОП на 50—60% от нормы (до 30—20 мкВ), умеренное снижение амплитуды b-волны на 15—20% (до 110 мкВ);

— II степень (средняя): наличие средней зоны неперфузии макулы (от 1 до 2 квадрантов), снижение ОП на 65—80% от нормы (до 20—15 мкВ), умеренное снижением амплитуды b-волны на 20—30% (до 100 мкВ);

— III степень (тяжелая): наличие большой зоны неперфузии макулы (от 2 и более квадрантов), выраженное снижение ОП на 80% и выше (менее 15 мкВ), амплитуды b-волны на 40% и выше (менее 100 мкВ).

Как видно из табл. 3, именно эти параметры позволяют наиболее четко дискриминировать 2 группы — с достаточным и недостаточным клиническим эффектом. Так, у всех пациентов с низкой эффективностью терапии была определена II и III степень ишемии сетчатки по разработанной классификации [25].

Согласно данным сравнительного анализа исходного цитокинового статуса пациентов с ОВС, оппозитных по клиническому эффекту анти-ВЭФР-терапии (табл. 4), пациенты с недостаточным клиническим эффектом характеризовались значимым увеличением концентрации не только ВЭФР (что подтверждает глубину ишемии), но и хемокинов (ИЛ-8, МХБ-1), демонстрирующих степень выраженности воспалительного процесса, а также противовоспалительных ЦК (ИЛ-10, -13), что свидетельствует об интенсивности, но недостаточной эффективности работы компенсаторных механизмов, направленных на ограничение локального воспаления.

Таблица 4. Исходный цитокиновый статус пациентов с ОВС с достаточным (+) и недостаточным (–) клиническим эффектом анти-ВЭФР-терапии, M±SD

Как показали результаты проведенных исследований, предикторами недостаточного клинического эффекта антиангиогенной терапии в виде однократной инъекции ранибизумаба может выступать не только анатомическая локализация окклюзии вены сетчатки (у больных с ОЦВС эффективность ниже, чем с ОВВС), а и в большей степени ишемия сетчатки II, III степени, включение в патологический процесс зоны fovea, а также максимально высокий уровень ЦК (ВЭФР, МХБ-1, ИЛ-8, -10, -13). Полученные данные могут послужить основой для дальнейшего определения пороговых значений концентрации ЦК во влаге передней камеры глаза с помощью метода анализа ROC-кривых (ROC-анализ), что позволит повысить диагностическую точность прогностической модели в отношении клинической эффективности антиангиогенной терапии.

В целях определения механизмов анти-ВЭФР-терапии был проведен многофакторный дискриминантный анализ всей совокупности признаков, включая концентрацию исследуемых ЦК и основных офтальмологических показателей у пациентов с достаточным и недостаточным клиническим эффектом. Для осуществления расчетов всех пациентов разделили на 4 группы: по их исходному состоянию с последующим достаточным и недостаточным эффектом от анти-ВЭФР-терапии — на 1-ю и 2-ю группы, соответственно, и по состоянию после введения ранибизумаба с достаточным и недостаточным эффектом от антиангиогенной терапии — на 3-ю и 4-ю группы, соответственно. Дискриминантный анализ проводился по следующей схеме (см. рисунок): между пациентами внутри пар групп (1—2-я и 3—4-я группы) и внутри троек групп (1—3-я и 2—4-я группы).

Схема дискриминантного исследования пациентов с достаточным и недостаточным клиническим эффектом анти-ВЭФР-терапии и данные сравнения между исследуемыми группами.

Наиболее информативными критериями, позволяющими с высоким уровнем достоверности определить механизмы саногенетического эффекта ранибизумаба у пациентов с достаточным клиническим эффектом, было не только предсказуемое снижение концентрации ВЭФР (F=51,9; р<0,0001), но и изменение морфофункционального состояния ретинальной ткани: уменьшение толщины сетчатки в макулярной зоне (F=45,3; р<0,0001), увеличение амплитуд b-волны ЭРГ (F=8,7; р<0,006) и осцилляторных потенциалов (F=6,9; р<0,02). Введение ранибизумаба также способствовало существенной депрессии ЦК воспалительного звена: ИЛ-15 (F=16,1; р<0,0005), ИЛ-6 (F=13,7; р<0,001) и ИЛ-8 (F=8,6; р<0,01).

В случаях недостаточного клинического эффекта, механизм действия ранибизумаба, помимо снижения уровня ВЭФР (F=87,9; р<0,0001), сопровождался лишь изменениями уровня ЦК раИЛ-1 и ИЛ-12p70, что не вызвало существенного снижения макулярного отека и восстановления функциональной активности сетчатки.

Важным представляется результат, полученный при анализе совокупности всех исследуемых признаков между группами с достаточным и недостаточным клиническим эффектом лечения в до- и послеоперационном период (1—2-я и 3—4-я группы). Единственным в исходном состоянии и наиболее значимым в послеоперационном периоде критерием, определяющим различие исследуемых групп, явился индекс осцилляторных потенциалов, характеризующий уровень ишемизации сетчатки.

Высокий уровень значимости F-критерия Фишера позволяет сделать вывод об адекватности построенной модели реальному процессу.

Заключение

Результаты проведенного исследования показывают, что ОВС сопровождается иммуновоспалительными процессами с повышенной экспрессией не только ВЭФР, но и других про- и противовоспалительных цитокинов и хемокинов. Выраженность цитокиновых реакций коррелирует с глубиной ишемического повреждения сетчатки. Интравитреальное введение ранибизумаба сопровождается снижением уровня ВЭФР и других цитокинов и/или хемокинов во внутриглазной жидкости. Определение степени ишемии сетчатки до начала лечения позволяет прогнозировать эффективность анти-ВЭФР-терапии и определить необходимость и/или тактику дополнительных лечебных мероприятий.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: А.Щ., Т.Ю., И.З., Е.Ч.

Сбор и обработка материала: И.З.

Протеомный анализ: А.О.

Статистическая обработка: И.З.

Написание текста: И.З., Т.Ю.

Редактирование: А.Щ., Т.Ю., А.О.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail