Буллезная кератопатия (БК) или эндотелиально-эпителиальная дистрофия (ЭЭД) роговицы — часто встречающееся патологическое состояние, развивающееся вследствие декомпенсации функции роговичного эндотелия и характеризующееся стойким отеком роговицы [11].
Развитие послеоперационной буллезной кератопатии (ПБК) происходит в результате потери эндотелиальных клеток (ЭК) роговицы во время хирургических манипуляций.
В англоязычной медицинской литературе ранняя ПБК обозначается термином «внезапная буллезная кератопатия» или «внезапный необратимый отек роговицы» («irreversible immediate corneal edema», «irreversible BK»), возникший «на операционном столе» и неразрешающийся за все время наблюдения [16, 23, 25].
Следует отметить, что консервативное лечение ПБК неэффективно, а бóльшая часть хирургических методов лечения имеет те или иные недостатки, которые ограничивают область их клинического применения.
Эффективной может оказаться клеточная терапия (КТ), однако в этом случае требуется решение ряда вопросов: необходимо иметь постоянно доступный источник клеток, использовать безопасный и экономичный метод их выделения и процессинга, исключить или в крайнем случае минимизировать возможность развития иммунного конфликта, обеспечить полную биологическую безопасность для пациента, реально оценивать техническую сложность применяемых методов, материальные затраты, законодательные и этические ограничения.
Решением вышеперечисленных проблем являются технологии персонализированной клеточной терапии (ПКТ), в которых для лечения пациента используются его собственные (аутологичные) клетки, полученные и сохраненные заранее либо полученные непосредственно перед проведением лечения [13, 26]. Естественно, что для каждой конкретной клеточной технологии будет характерен уникальный алгоритм получения, хранения, процессинга и применения аутологичных клеток или клеточного продукта.
В НИИ глазных болезней РАМН коллективом авторов (А.А. Каспаров, Евг.А. Каспарова, А.С. Павлюк) разработан и применяется метод ПКТ, известный по прежним публикациям как локальная экспресс-аутоцитокинотерапия. Метод применяется в двух модификациях — наружная ПКТ и интракамеральная ПКТ. Наружная ПКТ предполагает субконъюнктивальное введение и инстилляции смеси цельной аутологичной крови и комплекса полиА:полиУ (препарата Полудан). Такая модификация используется при эпителиально-стромальных поражениях роговицы и конъюнктивы (упорные и часто рецидивирующие герпетические кератиты, осложненные аденовирусные кератоконъюнктивиты, термохимические ожоги 1—2-й степени, замедленная реэпителизация после фоторефракционной и фототерапевтической кератэктомии). Метод интракамеральной ПКТ заключается в инкубации in vitro крови пациента со стимулятором (Полудан), сборе сыворотки со взвешенными в ней активированными лейкоцитами и введении полученного клеточного препарата (КП) в переднюю камеру глаза пациента. Приоритет на изобретение закреплен патентами на изобретения: №2165747 «Способ лечения поствоспалительной буллезной кератопатии» и №2357743 «Средство для лечения, способ получения средства для лечения и способ лечения отека роговицы и других проявлений ранней буллезной кератопатии».
Далее в данной статье под термином ПКТ мы будем подразумевать интракамеральную модификацию ПКТ.
Спектр стимуляторов, используемых для проведения КТ, ограничен теми субстанциями, применение которых разрешено законодательно. В случае интраоперационной ПКТ в офтальмологии препарат должен быть разрешен к внутриглазному введению.
При приготовлении КП для ПКТ используется синтетический комплекс полиадениловой—полиуридиловой кислот, структурный аналог двухспиральной вирусной РНК, реализующий свое действие через Toll-like рецепторы 3-го и 7-го типа, препарат Полудан, разрешенный к внутриглазному применению и более 10 лет успешно используемый в офтальмологической практике [31]. Кроме того, на клетки оказывают активирующее влияние и другие процессы — свертывание крови, имитирующее течение раневого процесса, температура 37 °С, усиливающая интенсивность синтетических процессов.
Важнейшим требованием при проведении КТ является характеристика и стандартизация клеточного продукта [5]. Мы провели ряд исследований, в результате которых было установлено, что предлагаемый метод сбора клеток в аутологичной сыворотке вокруг сгустка свернувшейся крови позволяет получить КП с высоким содержанием жизнеспособных клеточных элементов, из 8 мл крови можно получить 2—4 мл КП с концентрацией ядросодержащих клеток 3·106 кл/мл и жизнеспособностью 70—90%.
Было исследовано, какие именно клеточные популяции входят в состав КП; установлено, что соотношение гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов отличается от соотношения в цельной крови; содержание мононуклеарной фракции снижено в 1,3 раза и увеличена доля гранулоцитов, T-хелперы, T-цитотоксические и NK-клетки присутствуют в КП в тех же пропорциях, что и в периферической крови, тогда как содержание В-лимфоцитов снижено почти в 5 раз [1].
Первое исследование эффективности ПКТ было проведено у больных с ранними проявлениями герпес-вирусного кератоиридоциклита и эндотелиита, имевшего тенденцию к прогрессированию. ПКТ оказалась более эффективной, чем лечение одним Полуданом интракамерально. Выздоровление было достигнуто у 84 и 56% больных соответственно (p<0,01). Средняя острота зрения существенно возросла в группе ПКТ: 0,11±0,2 до лечения и 0,6±0,3 после.
Обнаруженная значимая разница в эффективности лечения (28%), по нашему мнению, была связана с более выраженным терапевтическим воздействием ПКТ на патологический процесс в эндотелии и задних слоях стромы роговицы по сравнению с одним Полуданом.
Учитывая сходство клинической картины при буллезном герпетическом увеокератите и ранней ПБК поражение эндотелия, наличие воспалительного компонента в их патогенезе, подтвержденные патогистологическими исследованиями [3, 5], а также отметив высокую клиническую эффективность методики ПКТ и ее выраженный регенераторный, противовоспалительный и противоотечный эффекты, мы решили применить ее в лечении ранней ПБК [6—8, 14, 31].
Для каждого конкретного метода КТ вопрос о механизмах лечебного действия требует отдельного изучения, однако принято считать, что механизмами, обусловливающими эффективность любой КТ, являются: заместительный механизм, когда введенные клетки физически заполняют собой дефект ткани, восстанавливая ее функцию, трофический, когда введенные в зону повреждения компоненты клеточного препарата продуцируют биологически активные вещества и/или модулируют активность клеток тканевой ниши путем паракринных или контактных воздействий [18, 22, 24]. Поэтому нами было проведено определение в составе КП биологически активных веществ — цитокинов и факторов роста, которые могут играть центральную роль в механизмах реализации его терапевтических эффектов [2]. Полученные значения приведены в табл. 1.
Установлено что цитокиновый профиль КП формируется за счет цитокинов:
— выделенных в ответ на стимуляцию полиА: полиУ (ИФН-α, ИЛ-1, -6, ФНО-α);
— спонтанно синтезированных за время инкубации (ИЛ-8);
— предсуществующих в плазме и сыворотке крови (TGFβ1, PDGF-AB, TGFβ2, VEGF, ИФН-γ и ИЛ-4).
Можно предположить, что при проведении интракамеральной ПКТ и замене водянистой влаги передней камеры глаза на КП наблюдаются явления, аналогичные полученным в культуре эндотелиоцитов: PDGF ускоряет заживление раневого дефекта; TGFβ1 приводит к стимуляции пролиферации клеток, усилению продукции коллагена и выработке эндогенного b-FGF эндотелиоцитами, который, в свою очередь, защищает клетки от апоптоза; VEGF стимулирует миграцию эндотелиоцитов в зону повреждения [15, 19, 27, 30, 32, 33].
Известно, что и другие обнаруженные цитокины играют роль в процессах регенерации. Так, ФНО-α регулирует процессы фиброгенеза в поврежденной роговице, ИЛ-1 индуцирует синтез b-FGF эндотелиоцитами после деструкции роговицы [28, 29]. Провоспалительные цитокины ослабляют межклеточные контакты между эндотелиоцитами, чем, предположительно, стимулируют эндотелий роговицы к делению, снимая один из механизмов его ингибирования [20].
Результаты определения цитокинового спектра КП позволили разработать схему предполагаемого механизма лечебного действия ПКТ (рис. 1).
Выделившиеся в результате стимуляции полиА: полиУ провоспалительные цитокины вкупе с ИЛ-8 ослабляют межклеточные контакты, чем снимают контактное ингибирование митоза, позволяя эндотелиоцитам осуществить деление или мигрировать и закрыть зону дефекта. Антиапоптотическому эффекту способствует наличие факторов роста, концентрация которых в водянистой влаге в норме снижена; они, кроме того, усиливают синтез внеклеточного матрикса, что стабилизирует барьерную функцию эндотелия. Прямой противовирусный эффект обеспечивается наличием в КП ИФН-α.
Все указанные выше процессы приводят к восстановлению барьерной функции эндотелия роговицы. После интракамеральной инъекции КП начавшиеся in vitro процессы синтеза и продукции цитокинов лейкоцитами продолжаются in vivo в передней камере глаза, обеспечивая таким образом пролонгированное локальное высвобождение биологически активных веществ, обусловливающих клинический эффект ПКТ.
Клинические данные
В период 2000—2013 гг. была выполнена интракамеральная ПКТ на 52 глазах с ранней ПБК (т.е. развившейся спустя 1—3 мес после операции) различной степени выраженности и генеза. Сеансы интракамеральной ПКТ проводились от 1 до 5 раз в зависимости от клинической динамики с интервалом 3—4 дня. В общей сложности было проведено 117 сеансов ПКТ.
Стадии БК варьировали от 1-й до 3-й (по классификации, предложенной авторами): 1-я стадия у 5 пациентов, 2-я — у 27, 3-я — у 20.
Пациенты предъявляли жалобы на резкое снижение остроты зрения, покраснение глаза, светобоязнь, слезотечение, ощущение инородного тела в глазу, боль. У 8 пациентов было компенсированное на гипотензивной терапии сопутствующее повышение внутриглазного давления (ВГД).
Состояние роговой оболочки характеризовалось наличием стойкого локального, чаще диффузного отека эндотелия, у некоторых пациентов — отложением на нем пигмента; выраженной складчатостью десцеметовой оболочки (в частности, после факоэмульсификации (ФЭ) складки были грубые и множественные, занимали от 40 до 80% площади роговицы), выраженным диффузным отеком стромы, буллезным отеком эпителия. Плотность эндотелиальных клеток (ПЭК) в большинстве случаев не определялась из-за выраженного отека стромы. Во всех случаях, несмотря на активно проводимое консервативное лечение в сроки от 2,5 нед до 1,5 мес (экспресс-инстилляции гиперосмотического раствора глюкозы, дексаметазона, солкосерила; курсы субконъюнктивальных инъекций дексаметазона, солкосерила; гелий-неоновый лазер, лечебные мягкие контактные линзы, гипотензивная терапия пациентам с повышенным ВГД), тенденции к выздоровлению не наблюдалось.
Острота зрения колебалась от правильной светопроекции до 0,6 и составляла в среднем 0,1±0,12.
Пациенты были в возрасте от 69 до 80 лет, большинство из них женщины. Сроки наблюдения составили от 3 мес до 7 лет.
Пациенты были разделены на три группы в зависимости от причины, приведшей к ПБК (табл. 2).
В 1-ю группу вошли 47 (90,4%) пациентов с ранней послеоперационной псевдоафакичной БК, развившейся после хирургии катаракты (ЭЭК+ИОЛ и ФЭ), у семи из них была ЭЭД Фукса.
Во 2-ю группу включено 4 (7,7%) пациента с ранней ПБК, развившейся после антиглаукоматозной операции, у двух из них ПБК развилась на фоне ЭЭД Фукса.
В 3-й группе была 1 (1,9%) пациентка с БК, развившейся спустя несколько лет после проникающего ранения роговицы, поверхностного химического ожога и травмирования длительно находившимся в передней камере мельчайшим осколком стекла.
В случае развития ПБК после осложненной заднекамерной имплантации ИОЛ (вывиха ИОЛ и ее опорных элементов, грыжи стекловидного тела и хрусталиковых масс) ПКТ проводили после устранения данных состояний.
Проведение ПКТ
В условиях операционной после ретробульбарной анестезии и выполнения парацентеза производили замещение влаги передней камеры на КП. Оставшуюся часть КП вводили под конъюнктиву паралимбально. Сразу же после операции больной принимал положение лицом вниз и лежал так в течение 2 ч.
Положение вниз лицом обеспечивает осаждение активированных клеточных элементов на задней поверхности роговицы и тем самым способствует непосредственному контакту с зоной поражения — эндотелиальными клетками и десцеметовой мембраной (контактное стимулирование).
Помимо контактного взаимодействия, повторные сеансы ПКТ обеспечивают циркуляцию в передней камере глаза растворенных в аутологичной сыворотке цитокинов, в том числе факторов роста (трофический компонент ПКТ).
Обследование
Пациентам проводили общеофтальмологическое обследование, включавшее биомикроскопию, визометрию, пневмотонометрию (при невозможности ее выполнения ВГД измеряли транспальпебральным тонометром ТГДЦ 01А), фоторегистрацию, зеркальную микроскопию.
У ряда больных для определения толщины роговицы использовали анализатор биомеханических свойств роговицы Пентакам (Pentacam, «Oculus», Германия). Прижизненную конфокальную микроскопию роговицы проводили с использованием конфокального микроскопа Confoscan-4 («Nidek», Япония) с увеличением 500.
Лечебный эффект ПКТ оценивали как «выраженный» при:
— расправлении более 70% складок десцеметовой оболочки;
— полной резорбции отека стромы;
— исчезновении буллезных изменений эпителия;
— повышении прозрачности и уменьшении толщины роговой оболочки;
— приросте остроты зрения от 0,25 до 0,9.
Эффект расценивали как «частичный» при:
— расправлении 40—50% складок;
— частичной резорбции отека;
— исчезновении буллезных изменений эпителия роговицы;
— приросте остроты зрения от 0,05 до 0,2.
При отсутствии эффекта первоначальные буллезные изменения роговицы сохранялись.
Клинический эффект
Из числа пациентов, получавших сеансы ПКТ, выраженный терапевтический эффект был отмечен у 44,2%. Частичный эффект наблюдался у 21,1% больных, отсутствие эффекта — у 34,6% больных.
Прирост остроты зрения в группе пациентов с выраженным эффектом составил 0,49±0,27, у пациентов с частичным эффектом — 0,12±0,04 (p≤0,05) (табл. 3).
У двух больных из группы с выраженным эффектом наблюдались рецидивы БК: через год после ПКТ у одной пациентки на фоне повышения ВГД и спустя 3 года на фоне ОРВИ у другой больной.
О резорбции отека также свидетельствует уменьшение толщины роговицы после проведения ПКТ. Средние показатели пахиметрии до лечения составляли 801±112 мкм, после проведения ПКТ — 582±55 мкм (p≤0,05).
Следует отметить, что чем раньше (т.е. в первые недели или месяцы) после возникновения отека проводится процедура ПКТ, тем чаще впоследствии мы наблюдаем выраженный терапевтический эффект. Это, по-видимому, связано с тем, что необратимые апоптотические и дистрофические изменения десцеметовой мембраны и эндотелия роговицы прогрессируют уже в течение первых месяцев после развития ПБК [26, 31]. Эффект ПКТ начинает проявляться уже в первые дни после процедуры и, как правило, максимально развивается спустя 1—3,5 мес после ее проведения.
Исследование эндотелия роговицы методом прижизненной конфокальной микроскопии (ПКФМС)
Исследование эндотелия роговицы методом ПКФМС (визуализация и подсчет ЭК) у больных с ранней ПБК до проведения ПКТ, как правило, оказывалось невозможным ввиду выраженного отека роговицы. После проведения ПКТ в группе пациентов с выраженным и частичным эффектом отек роговицы резорбировался, прозрачность роговицы восстанавливалась и ПКФМС давала возможность визуализировать структуру роговицы, определить состояние кератоцитов, а также количественные и качественные характеристики эндотелия.
Так, средние значения ПЭК после лечения составили 1080±463. Ядра, визуализируемые в кератоцитах и эндотелии, были крупными и гиперрефлективными, что свидетельствует об интенсивно протекающих синтетических процессах.
Многие эндотелиоциты были полиплоидными (имели по 2 ядра и более). У ряда пациентов полиплоидные ядра сохраняются спустя 3—5 лет после проведения ПКТ [9]. При этом, несмотря на то что ПЭК у этих больных относительно низкая (760—1229 клеток/мм), прозрачность роговицы сохраняется и рецидива отека не наблюдается. При контрольном обследовании парных глаз этих больных методом конфокальной микроскопии двойных ядер в эндотелиальных клетках не обнаружено. Наличие полиплоидных ядер свидетельствует о том, что в результате применения ПКТ, вероятно, в эндотелии реализуются регенеративные процессы, приводящие в том числе к незавершенному митозу. Такие клетки сохраняют функциональную активность и обеспечивают нормальные метаболические процессы в монослое эндотелия в условиях возрастной физиологической убыли клеток. По данным В.Я. Бродского и И.В. Урываевой, полиплоидизирующий митоз, в результате которого увеличивается количество ядер и происходит увеличение размеров клеток, является вариантом регенерации в условиях монослоя, его наличие подтверждает способность эндотелия роговицы к делению [4, 12].
Деление эндотелиоцитов роговицы человека описано в литературе. Стимуляция деления ЭК зафиксирована при ослаблении межклеточных контактов в результате травмы, под воздействием ЭДТА или провоспалительных цитокинов и факторов роста, добавляемых вместо компонентов водянистой влаги передней камеры, а также при контакте с сывороткой крови [10, 17, 21, 23].
Все эти факторы присутствуют и в случае применения интраоперационной ПКТ для лечения ПБК — на эндотелии имеется операционный дефект, а в переднюю камеру вводится, замещая собой водянистую влагу, КП в аутологичной сыворотке крови, содержащий в своем составе цитокины и факторы роста.
Далее приводим клинические случаи.
Случай 1. Пациентка К., 52 года.
Пациентка обратилась в НИИГБ РАМН спустя месяц после ФЭ катаракты с имплантацией ИОЛ с жалобами на низкое зрение и «туман» перед правым глазом. Активное консервативное лечение, проводимое в течение 4 нед после операции, было неэффективным. С диагнозом «OD—вторичная ЭЭД роговицы, артифакия, состояние после субтотальной витрэктомии и ревизии полости стекловидного тела, периферическая хориоретинальная дистрофия» пациентка была госпитализирована в стационар НИИГБ РАМН.
При поступлении острота зрения правого глаза составляла счет пальцев у лица, ВГД OD — 9,1 мм рт.ст., при проведении биомикроскопии OD отмечали выраженный отек роговицы, преимущественно ее задних слоев, грубую складчатость десцеметовой оболочки по всей площади роговицы (рис. 2, а) пахиметрия и ПЭК методом зеркальной микроскопии не определялись. Толщину роговицы удалось измерить лишь с помощью метода сканирующих срезов на приборе Пентакам — 970 мкм в центре и 1022 мкм парацентрально. Из-за выраженного отека всех слоев дифференцировка структур роговицы методом ПКФМС была невозможна (см. рис. 2, б).
До операции ФЭ ПЭК на правом глазу составляла 2263 клеток/мм.
17.12.2009 на OD была выполнена ПКТ. На следующий день отмечалась резко положительная динамика — полная резорбция отека роговицы в центральной и парацентральной областях роговицы, расправление практически всех складок десцеметовой оболочки (см. рис. 2, в), восстановление прозрачности роговицы и повышение остроты зрения до 0,5. В течение 20 ч после процедуры ПКТ толщина роговицы уменьшилась на 475 мкм и составила 495 мкм. Данные конфокальной микроскопии на 1-е сутки после ПКТ на OD: единичные гиперрефлективные наложения на эндотелии (возможно, лейкоцитарная взвесь), выраженный полиморфизм и полимегатизм ЭК, ПЭК 1799—1851 клеток/мм, единичные складки десцеметовой оболочки и задних слоев стромы, строма структурна, умеренно повышена рефлективность кератоцитов, базальный слой эпителия сохранен, границы между клетками несколько стушеваны (см. рис. 2, г—е).
В течение последующего месяца остаточный отек задних слоев стромы исчез полностью, толщина роговицы стабильно составляла 495 мкм, острота зрения правого глаза повысилась до 0,8. Прозрачность роговицы и острота зрения сохраняются стабильными в течение 4 лет наблюдения (см. рис. 2, ж—к).
Случай 2. Пациентка Ш., 72 года.
Пациентка обратилась в ГУ НИИГБ РАМН спустя 1,5 мес после операции ФЭ с имплантацией ИОЛ с жалобами на ощущение инородного тела и «затуманивание зрения» правого глаза. В течение 1,5 мес пациентка получала консервативное лечение, которое не дало эффекта.
При осмотре роговицы правого глаза определялся нежный диффузный отек эпителия и стромы, плоские обширные буллы в центре и на периферии (рис. 3, а). Острота зрения на OD составляла 0.6, толщина роговицы — 715 мкм в центре. При зеркальной микроскопии эндотелия роговицы OD ПЭК не определялась ввиду отека (см. рис. 3, б). На парном глазу отмечены явления ЭЭД Фукса. 10.02.2010 и 17.02.2010 в операционной было выполнено 2 сеанса ПКТ OD, после которых отмечали постепенную резорбцию отека стромы роговицы. Острота зрения повысилась на 0,2 и при выписке составляла 0,8.
Вследствие повышения прозрачности роговицы уже через месяц после ПКТ стала возможна визуализация эндотелия с помощью ПКФМС OD: отмечается выраженный полиморфизм ЭК, ПЭК 648,5 клеток/мм, повышенная рефлективность кератоцитов, прозрачность межклеточного матрикса снижена, особенно в передних слоях стромы. Эпителий — резко повышена рефлективность межклеточных границ базального слоя. Пахиметрия OD — 621 мкм в центре. Через 3 мес после ПКТ острота зрения OD составила 1,0.
Спустя 3 года пахиметрия роговицы OD составляет 568 мкм в центре (см. рис. 3, в). ПЭК OD 864 клеток/мм, vis OD — 1,0. ПКФМС OD: визуализируются ЭК с двойными ядрами (см. рис. 3, г, д). Задняя и средняя строма без особенностей, в передних стромальных слоях — умеренный отек экстрацеллюлярного матрикса, базальный слой эпителия сохранен, в эпителии единичные десквамированные клетки поверхностного слоя (см. рис. 3, е, ж). В течение 3 лет наблюдения состояние роговицы и острота зрения стабильны.
Заключение
Персонализированная клеточная терапия (ПКТ) с использованием аутологичных клеточных продуктов открывает новые возможности для эффективного лечения ранней ПБК, развившейся в первые месяцы после микрохирургических операций, и позволяет решить ряд имеющихся на сегодняшний день проблем (безопасный и экономичный способ получения клеточного материала, исключение возможности иммунологического конфликта и др.).
Исследования клеточного и цитокинового состава КП для проведения ПКТ позволили сформулировать возможные фундаментальные механизмы терапевтического действия ПКТ: провоспалительные цитокины вкупе с ИЛ-8 ослабляют межклеточные контакты, чем, вероятно, снимают контактное ингибирование митоза, позволяя эндотелиоцитам поделиться или мигрировать и закрыть зону дефекта; антиапоптотическому эффекту способствует наличие факторов роста, концентрация которых в водянистой влаге в норме снижена, они, кроме того, усиливают синтез внеклеточного матрикса, что стабилизирует барьерную функцию эндотелия, о чем также свидетельствует наличие полиплоидных ядер в эндотелии роговицы у ряда пациентов.
Разработанный нами метод проведения ПКТ, позволяющий получить из небольшого объема периферической крови пациента КП, представляющий собой взвесь аутологичных лейкоцитов в насыщенной цитокинами (процессированной) сыворотке, прошел успешные клинические испытания. Полученные результаты свидетельствуют о его терапевтической эффективности и безопасности применения в офтальмологической клинике для лечения ранней ПБК. Выраженный терапевтический эффект достигнут в 44,2% случаев, при этом прирост остроты зрения составил 0,49±0,27. Достигнуто снижение толщины роговицы с 801±112 до 582±55 мкм. О нормализации структуры роговицы после ПКТ также свидетельствуют данные ПКФМС.
ПКТ в настоящее время является единственным эффективным методом лечебного воздействия на клетки поврежденного эндотелия, не требующим трансплантации роговицы, у пациентов с ранней послеоперационной буллезной кератопатией.