Контроль неоваскуляризации как в норме, так и при патологии необходим для поддержания прозрачности роговицы. Показано, что протеолитические ферменты, в том числе компоненты фибринолитической системы (ФС), вовлечены в регулирование ангиогенеза. Плазмин играет двойную роль в контроле процесса пролиферации эндотелия в зависимости от фазы развития ангиогенеза. Известно, что плазмин вместе с активированными им металлопротеиназами на начальном этапе роста сосудов разрушает межклеточный матрикс, создавая условия для миграции эндотелиальных клеток, необходимых для формирования новых сосудов [10]. Кроме того, плазмин может стимулировать поступление в ткани факторов роста клеток, таких как VEGF и bFGF [15]. Разрастание кровеносных сосудов предотвращают эндогенные ингибиторы ангиогенеза, среди них — ангиостатины, образующиеся в результате протеолиза плазминогена различными протеазами или аутолиза плазмина [7].

В 1994 г. впервые было обнаружено, что фрагмент тяжелой цепи плазмин(оген)а, содержащий первые 4 (из 5) крингл-домена (К1—4) и названный ангиостатином, подавляет ангиогенез и рост опухоли [14]. Каждый крингл состоит из 80 аминокислот, скрепленных тремя дисульфидными связями и сформированных в виде петель. Позднее путем протеолиза плазминогена или аутолиза плазмина были получены ангиостатин К1—3, содержащий первые 3 крингла, и ангиостатин К1—4,5, содержащий кринглы 1—4 и 85% крингла 5 плазминогена. Показано, что ангиостатин К1—3 является более слабым ингибитором пролиферации эндотелиальных клеток, чем ангиостатин К1—4 [7]. Ангиостатин К1—4,5 подавлял ангиогенез и рост опухоли в дозе, в 50 раз меньшей, чем К1—4 [8].

Установлено, что ангиостатин К1—3 оказывает ингибирующее действие на пролиферацию эндотелия при неоваскуляризации роговицы у кроликов, вызванной ангиогенином, bFGF и VEGF [11]. Таким образом, плазмин участвует в развитии ангиогенеза, а продукт деградации плазмин(оген)а — в ингибировании ангиогенеза.

Модель ожога роговицы ярко отображает все этапы ангиогенеза [3].

Цель исследования — изучить при ожоге роговицы у кроликов активность плазмина, уровень плазминогена в слезной жидкости, влаге передней камеры, конъюнктиве, роговице и оценить влияние инстилляций крингл-фрагмента плазминогена (К1—4,5) на неоваскуляризацию роговицы и другие клинические проявления ожоговой болезни глаз.

В эксперименте было задействовано 19 кроликов породы шиншилла массой тела 2—2,5 кг.

Для ожога роговицы под общим наркозом и местной анестезией на роговицу на 40 с наносили круги диаметром 7 мм из тонкой хлопчатобумажной ткани, пропитанные 10% раствором NaOH.

Слезную жидкость брали до ожога роговицы и в 1, 3, 7, 14, 21 и 28-е сутки после ожога (3 кролика, 6 глаз) с помощью фильтровальной бумаги. Компоненты слезы элюировали физиологическим раствором. Элюат центрифугировали и надосадочную жидкость использовали для исследования. Три кролика служили контролем.

У 2 интактных кроликов (4 глаза) и у 2 подопытных кроликов (4 глаза) на 3-й день после ожога производили отбор водянистой влаги парацентезом. Сразу после забоя кроликов энуклеировали оба глаза, далее выделяли бульбарную конъюнктиву и роговицу. Ткани гомогенизировали на холоде в физиологическом растворе, гомогенат центрифугировали, отбирали надосадочную жидкость и хранили при –20 °С.

Для определения содержания плазминогена в исследуемых образцах превращали его в активный комплекс плазмин—стрептокиназа добавлением избытка стрептокиназы. Уровни плазмина и потенциально активного плазминогена в слезе, водянистой влаге, гомогенатах роговицы и конъюнктивы определяли спектрофотометрически по скорости гидролиза хромогенного субстрата p-нитроанилида HCO-Ala-Phe-Lys (AFK-pNA) [4]. Концентрацию белка определяли по методу Лоури [12].

Ангиостатин К1—4,5 получали путем активации Glu-плазминогена урокиназой и аутолиза полученного плазмина при щелочных значениях pH. После очистки К1—4,5 лиофилизировали.

На 9 кроликах изучали влияния ангиостатина на течение ожоговой болезни глаз (4 кролика (8 глаз) — опытная группа; 5 кроликов (10 глаз) — контрольная группа). К1—4,5 вводили кроликам ежедневно в виде субконъюнктивальных инъекций 100 нМ (0,1 мл) в течение 3 нед начиная со дня нанесения ожога роговицы. Проявления постожогового воспалительного процесса оценивали в 1, 3, 7, 14, 21 и 28-е сутки с помощью биомикроскопии до и после окрашивания роговицы 0,5% раствором флюоресцеина. Оценивали площадь дефекта эпителия, глубину изъязвления стромы, отек роговицы, интенсивность неоваскуляризации роговицы (длина и густота новообразованных сосудов) в условных баллах по принятой в лаборатории методике.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента.

В слезе после ожога роговицы наблюдали 2 периода подъема активности плазмина — на 3-и и 14—21-е сутки, т.е. когда усиливалось изъязвление роговицы. Уровень плазминогена был повышен в течение всего периода наблюдения с пиком на 7-е сутки (увеличение в 2 раза) (рис. 1).

В роговице, конъюнктиве и водянистой влаге до ожога были выявлены плазмин и плазминоген. На 3-и сутки после ожога роговицы активность плазмина значительно повышалась во влаге передней камеры, роговице и конъюнктиве, там же обнаружена тенденция к увеличению уровня плазминогена, при этом в роговице уровень плазминогена достоверно возрастал после ожога (рис. 2).

Таким образом, после ожога роговицы происходит увеличение уровней плазминогена и плазмина в роговице, конъюнктиве и водянистой влаге, что может быть одной из причин стимуляции ангиогенеза.

После начала субконъюнктивальных инъекций К1—4,5 у подопытных кроликов рост сосудов был заметно меньше, чем у контрольных животных (рис. 3).

Лечение ангиостатином оказывало положительное влияние на изъязвление роговицы. В группе кроликов, получавших ангиостатин, язвы роговицы после ожога были статистически достоверно менее глубокими, чем в контрольной группе (см. рис. 3, в). В опытной группе площадь эрозии роговицы была достоверно меньше на 7-е и 14-е сутки (см. рис. 3, г).

Выявленное нами повышение уровней плазмина и плазминогена в слезе после ожога роговицы у кроликов указывает на активное участие этих компонентов ФС в репарации ожоговой раны. То же отмечено и у человека. Показано, что даже незначительная травма роговицы, наблюдаемая, например, при тесте Ширмера, приводит к активации плазминогена и увеличению содержания в слезе плазмина [16]. Повышение активности плазмина в слезе отмечалось у больных с химическим ожогом, после механической травмы, с бактериальными и труднозаживающими язвами роговицы [1].

Присутствие плазмина способствует как очищению роговицы от белковых отложений, так и заживлению микротравм [16]. Плазмин также участвует в расщеплении фибронектина, хемотаксисе полиморфно-ядерных лейкоцитов, реакции ограниченного протеолиза, активирующего протеолитические ферменты, в частности металлопротеазы, которые, как и плазмин, участвуют в неоваскуляризации и изъязвлении роговицы [13, 17].

В конъюнктиве интактных кроликов выявлены как плазминоген, так и плазмин, а после ожога их уровень значительно возрастал. Имеются данные о том, что плазмин, помимо своей фибринолитической функции, обладает способностью вызывать расширение кровеносных сосудов за счет активации выброса монооксида азота из эндотелиальных клеток [2]. В острой фазе ожоговой болезни наблюдается ярко выраженное расширение сосудов лимбальной зоны конъюнктивы, в развитии которого может принимать участие плазмин.

Мы обнаружили, что в водянистой влаге интактных кроликов присутствует плазмин и плазминоген. В норме он необходим, возможно, для удаления фибриновых микросгустков из передней камеры глаза, с внутренней поверхности роговицы, а также для поддержания проходимости трабекулярной сети: это обеспечивается с помощью тканевого активатора плазминогена, преобразующего плазминоген в плазмин [9]. После ожога происходит многократное повышение уровня плазмина, в меньшей степени — плазминогена, что, по-видимому, может оказывать влияние на состояние путей оттока водянистой влаги из глаза и на уровень внутриглазного давления.

Таким образом, при ожоге роговицы в конъюнктиве, роговице, слезе и влаге передней камеры происходит повышение активности плазмина и уровня плазминогена, которые наряду с другими функциями участвуют в регуляции ангиогенеза.

После введения ангиостатина К1—4,5 при ожоге глаз мы наблюдали мощное ингибирование неоваскуляризации роговицы. В течение 2 нед отмечался гораздо более медленный рост сосудов, и они были единичны в отличие от контрольной группы. Однако последующее введение ангиостатина вызвало резкое разветвление сосудов в роговице. Поэтому можно сделать вывод о том, что ангиостатин для подавления неоваскуляризации роговицы следует применять не более 2 нед. По данным литературы, подавление пролиферации эндотелия, регресс новообразованных сосудов роговицы и противовоспалительный эффект наблюдался после инстилляций крингла К5 кроликам с ожогом роговицы [18]. После щелочного ожога глаз у мышей было также обнаружено снижение неоваскуляризации роговицы после введения К5 через осмотический насос [6].

Снижение интенсивности развития язв роговицы при местном лечении ангиостатином, видимо, объясняется не только подавлением продукции металлопротеиназ, но и воздействием ангиостатинов на иммунные процессы. Показано, что эндогенные ангиостатины являются иммуномодуляторами, так как усиливают продукцию инерлейкина-12 макрофагами [5].

Полученные данные свидетельствуют о перспективности разработки препаратов на основе ангиостатина К1—4,5 для подавления неоваскуляризации роговицы, а также для лечения заболеваний, сопровождающихся изъязвлением роговицы.