Чеснокова Н.Б.

ФГБУ Московский научно-исследовательский институт глазных болезней им. Гельмгольца Минздрава РФ, Москва

Айсина Р.Б.

Кафедра химической энзимологии химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Мухаметова Л.И.

Кафедра химической энзимологии химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Павленко Т.А.

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр глазных болезней им. Гельмгольца» Минздрава России, Москва, Россия

Гулин Д.А.

Кафедра химической энзимологии химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Безнос О.В.

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр глазных болезней им. Гельмгольца» Минздрава России, Москва, Россия

Компоненты фибринолиза и регуляция ангиогенеза на примере постожоговой неоваскуляризации роговицы у кроликов

Авторы:

Чеснокова Н.Б., Айсина Р.Б., Мухаметова Л.И., Павленко Т.А., Гулин Д.А., Безнос О.В.

Подробнее об авторах

Журнал: Вестник офтальмологии. 2012;128(4): 62‑65

Прочитано: 329 раз


Как цитировать:

Чеснокова Н.Б., Айсина Р.Б., Мухаметова Л.И., Павленко Т.А., Гулин Д.А., Безнос О.В. Компоненты фибринолиза и регуляция ангиогенеза на примере постожоговой неоваскуляризации роговицы у кроликов. Вестник офтальмологии. 2012;128(4):62‑65.
Chesnokova NB, Aĭsina RB, Mukhametova LI, Pavlenko TA, Gulin DA, Beznos OV. Fibrinolysis components and angiogenesis regulation by example of burn-induced corneal neovascularization in rabbits. Russian Annals of Ophthalmology. 2012;128(4):62‑65. (In Russ.)

Рекомендуем статьи по данной теме:
Прог­но­зи­ро­ва­ние рис­ка сни­же­ния ова­ри­аль­но­го ре­зер­ва пос­ле хи­рур­ги­чес­ко­го ле­че­ния па­ци­ен­ток с глу­бо­ким ин­фильтра­тив­ным эн­до­мет­ри­озом с ис­поль­зо­ва­ни­ем ис­кусствен­но­го ин­тел­лек­та. Рос­сий­ский вес­тник аку­ше­ра-ги­не­ко­ло­га. 2024;(3):92-102
Осо­бен­нос­ти ан­ги­оге­не­за при свет­лок­ле­точ­ном ра­ке поч­ки. Ар­хив па­то­ло­гии. 2024;(4):64-70
Осо­бен­нос­ти вли­яния про­вос­па­ли­тель­ных ци­то­ки­нов TNF-a и IL-1b на клет­ки эн­до­те­лия. Кар­ди­оло­ги­чес­кий вес­тник. 2024;(4-2):121-127
Ген­дер­ные осо­бен­нос­ти ан­ги­оге­не­за у боль­ных с не­мы­шеч­но-ин­ва­зив­ным ра­ком мо­че­во­го пу­зы­ря, ос­лож­нен­ным са­хар­ным ди­абе­том 2 ти­па. Про­фи­лак­ти­чес­кая ме­ди­ци­на. 2025;(3):73-79

Контроль неоваскуляризации как в норме, так и при патологии необходим для поддержания прозрачности роговицы. Показано, что протеолитические ферменты, в том числе компоненты фибринолитической системы (ФС), вовлечены в регулирование ангиогенеза. Плазмин играет двойную роль в контроле процесса пролиферации эндотелия в зависимости от фазы развития ангиогенеза. Известно, что плазмин вместе с активированными им металлопротеиназами на начальном этапе роста сосудов разрушает межклеточный матрикс, создавая условия для миграции эндотелиальных клеток, необходимых для формирования новых сосудов [10]. Кроме того, плазмин может стимулировать поступление в ткани факторов роста клеток, таких как VEGF и bFGF [15]. Разрастание кровеносных сосудов предотвращают эндогенные ингибиторы ангиогенеза, среди них — ангиостатины, образующиеся в результате протеолиза плазминогена различными протеазами или аутолиза плазмина [7].

В 1994 г. впервые было обнаружено, что фрагмент тяжелой цепи плазмин(оген)а, содержащий первые 4 (из 5) крингл-домена (К1—4) и названный ангиостатином, подавляет ангиогенез и рост опухоли [14]. Каждый крингл состоит из 80 аминокислот, скрепленных тремя дисульфидными связями и сформированных в виде петель. Позднее путем протеолиза плазминогена или аутолиза плазмина были получены ангиостатин К1—3, содержащий первые 3 крингла, и ангиостатин К1—4,5, содержащий кринглы 1—4 и 85% крингла 5 плазминогена. Показано, что ангиостатин К1—3 является более слабым ингибитором пролиферации эндотелиальных клеток, чем ангиостатин К1—4 [7]. Ангиостатин К1—4,5 подавлял ангиогенез и рост опухоли в дозе, в 50 раз меньшей, чем К1—4 [8].

Установлено, что ангиостатин К1—3 оказывает ингибирующее действие на пролиферацию эндотелия при неоваскуляризации роговицы у кроликов, вызванной ангиогенином, bFGF и VEGF [11]. Таким образом, плазмин участвует в развитии ангиогенеза, а продукт деградации плазмин(оген)а — в ингибировании ангиогенеза.

Модель ожога роговицы ярко отображает все этапы ангиогенеза [3].

Цель исследования — изучить при ожоге роговицы у кроликов активность плазмина, уровень плазминогена в слезной жидкости, влаге передней камеры, конъюнктиве, роговице и оценить влияние инстилляций крингл-фрагмента плазминогена (К1—4,5) на неоваскуляризацию роговицы и другие клинические проявления ожоговой болезни глаз.

Материал и методы

В эксперименте было задействовано 19 кроликов породы шиншилла массой тела 2—2,5 кг.

Для ожога роговицы под общим наркозом и местной анестезией на роговицу на 40 с наносили круги диаметром 7 мм из тонкой хлопчатобумажной ткани, пропитанные 10% раствором NaOH.

Слезную жидкость брали до ожога роговицы и в 1, 3, 7, 14, 21 и 28-е сутки после ожога (3 кролика, 6 глаз) с помощью фильтровальной бумаги. Компоненты слезы элюировали физиологическим раствором. Элюат центрифугировали и надосадочную жидкость использовали для исследования. Три кролика служили контролем.

У 2 интактных кроликов (4 глаза) и у 2 подопытных кроликов (4 глаза) на 3-й день после ожога производили отбор водянистой влаги парацентезом. Сразу после забоя кроликов энуклеировали оба глаза, далее выделяли бульбарную конъюнктиву и роговицу. Ткани гомогенизировали на холоде в физиологическом растворе, гомогенат центрифугировали, отбирали надосадочную жидкость и хранили при –20 °С.

Для определения содержания плазминогена в исследуемых образцах превращали его в активный комплекс плазмин—стрептокиназа добавлением избытка стрептокиназы. Уровни плазмина и потенциально активного плазминогена в слезе, водянистой влаге, гомогенатах роговицы и конъюнктивы определяли спектрофотометрически по скорости гидролиза хромогенного субстрата p-нитроанилида HCO-Ala-Phe-Lys (AFK-pNA) [4]. Концентрацию белка определяли по методу Лоури [12].

Ангиостатин К1—4,5 получали путем активации Glu-плазминогена урокиназой и аутолиза полученного плазмина при щелочных значениях pH. После очистки К1—4,5 лиофилизировали.

На 9 кроликах изучали влияния ангиостатина на течение ожоговой болезни глаз (4 кролика (8 глаз) — опытная группа; 5 кроликов (10 глаз) — контрольная группа). К1—4,5 вводили кроликам ежедневно в виде субконъюнктивальных инъекций 100 нМ (0,1 мл) в течение 3 нед начиная со дня нанесения ожога роговицы. Проявления постожогового воспалительного процесса оценивали в 1, 3, 7, 14, 21 и 28-е сутки с помощью биомикроскопии до и после окрашивания роговицы 0,5% раствором флюоресцеина. Оценивали площадь дефекта эпителия, глубину изъязвления стромы, отек роговицы, интенсивность неоваскуляризации роговицы (длина и густота новообразованных сосудов) в условных баллах по принятой в лаборатории методике.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение

В слезе после ожога роговицы наблюдали 2 периода подъема активности плазмина — на 3-и и 14—21-е сутки, т.е. когда усиливалось изъязвление роговицы. Уровень плазминогена был повышен в течение всего периода наблюдения с пиком на 7-е сутки (увеличение в 2 раза) (рис. 1).

Рисунок 1. Изменение активности плазмина и уровня плазминогена в слезе после ожога роговицы. По оси абсцисс — время после нанесения ожога, сут; по оси ординат — уровни плазмина и плазминогена, % от показателя у интактных кроликов; * — p<0,05 по сравнению с контролем.

В роговице, конъюнктиве и водянистой влаге до ожога были выявлены плазмин и плазминоген. На 3-и сутки после ожога роговицы активность плазмина значительно повышалась во влаге передней камеры, роговице и конъюнктиве, там же обнаружена тенденция к увеличению уровня плазминогена, при этом в роговице уровень плазминогена достоверно возрастал после ожога (рис. 2).

Рисунок 2. Изменение активности плазмина и содержание плазминогена в роговице, конъюнктиве и влаге на 3-и сутки после ожога роговицы. По оси ординат — уровни плазмина и плазминогена, % от показателя у интактных кроликов; * — p<0,05 по сравнению с контролем.

Таким образом, после ожога роговицы происходит увеличение уровней плазминогена и плазмина в роговице, конъюнктиве и водянистой влаге, что может быть одной из причин стимуляции ангиогенеза.

После начала субконъюнктивальных инъекций К1—4,5 у подопытных кроликов рост сосудов был заметно меньше, чем у контрольных животных (рис. 3).

Рисунок 3. Влияние ангиостатина К1—4,5 на клинические проявления ожоговой болезни глаз. а — длина сосудов; б — густота сосудов; в — глубина язв роговицы; г — площадь изъязвления роговицы. По оси абсцисс — время после нанесения ожога, сут; по оси ординат — степень выраженности клинического признака, условные баллы; * — p<0,05 по сравнению с контролем.
У леченых кроликов сосуды росли медленно и были очень редкими в течение первых 2 нед, однако на 3-й неделе в месте врастания их в зону ожога сосуды интенсивно начали разветвляться, образуя густую щетку (см. рис. 3, а, б).

Лечение ангиостатином оказывало положительное влияние на изъязвление роговицы. В группе кроликов, получавших ангиостатин, язвы роговицы после ожога были статистически достоверно менее глубокими, чем в контрольной группе (см. рис. 3, в). В опытной группе площадь эрозии роговицы была достоверно меньше на 7-е и 14-е сутки (см. рис. 3, г).

Выявленное нами повышение уровней плазмина и плазминогена в слезе после ожога роговицы у кроликов указывает на активное участие этих компонентов ФС в репарации ожоговой раны. То же отмечено и у человека. Показано, что даже незначительная травма роговицы, наблюдаемая, например, при тесте Ширмера, приводит к активации плазминогена и увеличению содержания в слезе плазмина [16]. Повышение активности плазмина в слезе отмечалось у больных с химическим ожогом, после механической травмы, с бактериальными и труднозаживающими язвами роговицы [1].

Присутствие плазмина способствует как очищению роговицы от белковых отложений, так и заживлению микротравм [16]. Плазмин также участвует в расщеплении фибронектина, хемотаксисе полиморфно-ядерных лейкоцитов, реакции ограниченного протеолиза, активирующего протеолитические ферменты, в частности металлопротеазы, которые, как и плазмин, участвуют в неоваскуляризации и изъязвлении роговицы [13, 17].

В конъюнктиве интактных кроликов выявлены как плазминоген, так и плазмин, а после ожога их уровень значительно возрастал. Имеются данные о том, что плазмин, помимо своей фибринолитической функции, обладает способностью вызывать расширение кровеносных сосудов за счет активации выброса монооксида азота из эндотелиальных клеток [2]. В острой фазе ожоговой болезни наблюдается ярко выраженное расширение сосудов лимбальной зоны конъюнктивы, в развитии которого может принимать участие плазмин.

Мы обнаружили, что в водянистой влаге интактных кроликов присутствует плазмин и плазминоген. В норме он необходим, возможно, для удаления фибриновых микросгустков из передней камеры глаза, с внутренней поверхности роговицы, а также для поддержания проходимости трабекулярной сети: это обеспечивается с помощью тканевого активатора плазминогена, преобразующего плазминоген в плазмин [9]. После ожога происходит многократное повышение уровня плазмина, в меньшей степени — плазминогена, что, по-видимому, может оказывать влияние на состояние путей оттока водянистой влаги из глаза и на уровень внутриглазного давления.

Таким образом, при ожоге роговицы в конъюнктиве, роговице, слезе и влаге передней камеры происходит повышение активности плазмина и уровня плазминогена, которые наряду с другими функциями участвуют в регуляции ангиогенеза.

После введения ангиостатина К1—4,5 при ожоге глаз мы наблюдали мощное ингибирование неоваскуляризации роговицы. В течение 2 нед отмечался гораздо более медленный рост сосудов, и они были единичны в отличие от контрольной группы. Однако последующее введение ангиостатина вызвало резкое разветвление сосудов в роговице. Поэтому можно сделать вывод о том, что ангиостатин для подавления неоваскуляризации роговицы следует применять не более 2 нед. По данным литературы, подавление пролиферации эндотелия, регресс новообразованных сосудов роговицы и противовоспалительный эффект наблюдался после инстилляций крингла К5 кроликам с ожогом роговицы [18]. После щелочного ожога глаз у мышей было также обнаружено снижение неоваскуляризации роговицы после введения К5 через осмотический насос [6].

Снижение интенсивности развития язв роговицы при местном лечении ангиостатином, видимо, объясняется не только подавлением продукции металлопротеиназ, но и воздействием ангиостатинов на иммунные процессы. Показано, что эндогенные ангиостатины являются иммуномодуляторами, так как усиливают продукцию инерлейкина-12 макрофагами [5].

Полученные данные свидетельствуют о перспективности разработки препаратов на основе ангиостатина К1—4,5 для подавления неоваскуляризации роговицы, а также для лечения заболеваний, сопровождающихся изъязвлением роговицы.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо со ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail

Мы используем файлы cооkies для улучшения работы сайта. Оставаясь на нашем сайте, вы соглашаетесь с условиями использования файлов cооkies. Чтобы ознакомиться с нашими Положениями о конфиденциальности и об использовании файлов cookie, нажмите здесь.