КМ — костный мозг

МДС — миелодиспластический синдром

ММ — множественная миелома

ОВ — общая выживаемость

ОЛ — острый лейкоз

ПЦР-РВ — полимеразная цепная реакция в реальном времени

РА — рефрактерная анемия

РАИБ — рефрактерная анемия с избытком бластов

Миелодиспластические синдромы (МДС) представляют собой гетерогенную группу клональных заболеваний системы крови, характеризующихся цитопенией, признаками дисмиелопоэза и высоким риском трансформации в острые миелоидные лейкозы [1].

Начальным звеном в патогенезе МДС являются генетические изменения (точечные мутации, хромосомные аберрации), накапливающиеся в плюрипотентных клетках и приводящие к их повреждению и трансформации [2, 3]. При этом нарушаются процессы созревания в одном, двух или трех ростках гемопоэза, выражающиеся в изменении морфологических свойств и функциональной активности кроветворных клеток этих ростков [4]. В результате у пациентов с МДС наблюдается одно-, двух- или трехростковая цитопения в периферической крови на фоне гиперклеточного (реже нормо- или гипоклеточного) костного мозга (КМ) [5]. Кроме того, характерной особенностью МДС при различных вариантах его течения является неуклонное прогрессирование мультилинейной дисплазии неэффективного гемопоэза с дальнейшим увеличением бластных клеток в КМ и трансформацией в острый лейкоз (ОЛ) [6].

У больных с МДС отмечаются также повышение пролиферативной активности клеток КМ, изменение микроокружения, усиление ангиогенеза и активация Т-лимфо-цитов СD8⁺ [7]. Размножение бластных клеток при МДС находится под контролем разнообразных ауто- и паракринных сигнальных каскадов, способных в значительной степени модулировать их злокачественный фенотип и приводить к прогрессированию заболевания [8]. Одни из этих сигналов могут быть связаны с увеличенной экспрессией генов фактора роста эндотелия сосудов VEGF-A и двух его рецепторов — VEGFR1 и VEGFR2. Показано, что фактор роста VEGF-A и рецепторы VEGFR1 и VEGFR2 принимают участие не только в регуляции ангиогенеза и неоангиогенеза в нормальных условиях и при злокачественной трансформации, но и способствуют пролиферации клеток при многих солидных и несолидных опухолях [9, 10]. В частности, патогенетическое значение этой рецепторной системы установлено для множественной миеломы (ММ) и лимфом [11, 12]. В то же время значение экспрессии фактора роста VEGF-A, а также рецепторов VEGFR1 и VEGFR2 в качестве возможных молекулярных звеньев в патогенезе МДС и их роль как потенциальных диагностических и прогностических факторов при МДС мало исследована. Так, A. Aguayo и соавт. [13] не обнаружили прогностического значения уровня VEGF-A в сыворотке крови у пациентов с МДС, но выявили, что аналогичный показатель играет роль прогностического фактора у больных острым миелоидным лейкозом. В то же время S. Verstovsek и соавт. [14] показали, что высокие уровни экспрессии VEGF-A обратно коррелировали с общей выживаемостью (ОВ) у пациентов и с МДС, и с острым миелоидным лейкозом, тогда как уровни экспрессии рецепторов VEGFR1 и VEGFR2 не имели прогностической значимости в исследованных группах больных.

Цель исследования — изучить особенности экспрессии генов VEGF-A, VEGFR1 и VEGFR2 и оценить их возможное клинико-патогенетическое значение у пациентов с МДС.

Обследовали группу из 24 пациентов (15 женщин и 9 мужчин) с подтвержденным диагнозом МДС. Больных включали в исследование только при появлении клинического значения клеточной дисфункции КМ, потребовавшей проведения гемотрансфузионной и/или патогенетической терапии перед началом лечения. У всех пациентов получено информированное согласие на проведение клинического исследования. Возраст пациентов находился в диапазоне от 51 года до 85 лет (медиана 71,5 года). Диагноз МДС основывался на результатах цитологического исследования клеток периферической крови: наличии анемического синдрома, часто в сочетании с лейкопенией, реже с тромбоцитопенией и увеличением бластных клеток. Среди эритроцитов определялись как микро-, так и макроциты, пойкилоцитоз. Нейтрофилы характеризовались изменением сегментированности ядер, наличием пельгероидных форм. Дисплазия тромбоцитов заключалась в появлении аномальных форм со сниженной способностью к агрегации. При анализе миелограммы отмечалась редукция (до 5—10%) либо расширение эритроидного ростка с характерными мегалобластоидными чертами кроветворения. В гранулоцитарном ростке выявлялись те же изменения клеток, что и в нейтрофилах периферической крови. Признаки дисплазии мегакариоцитов заключались в появлении как гигантских, так и мелких одно—двуядерных форм. Количество бластных клеток в КМ варьировало от 1,2 до 18,8% (медиана 8,4%). Пациентов с гипопластическим вариантом МДС в исследование не включали. Вариант МДС уточняли по классификации МДС ВОЗ [15]. Он базировался на следующих показателях: увеличение количества бластных клеток в КМ, одно-, двух- или трехростковый цитопенический синдром, изменения кариотипа. Риск развития ОЛ рассчитывали по шкале IPSS. Среди пациентов, включенных в это исследование, у 3 диагностирована рефрактерная анемия (РА), у 5 — МДС, ассоциированный с изолированной делецией del (5q), у 1 — РА с кольцевыми сидеробластами, у 4 — рефрактерная цитопения с мультилинейной дисплазией, у 4 — РА с избытком бластов (РАИБ) 1-го типа и у 7 — РАИБ 2-го типа. Цитогенетический анализ аспиратов КМ показал следующие результаты: отсутствие изменений кариотипа выявлено у 10 пациентов. У 14 установлены следующие хромосомные аномалии: у 2 — del (20q), у 5 — del (5q), у 2 — del (7q), у 5 —множественные клональные перестройки кариотипа.

Используя Международную систему числовой оценки прогноза IPSS (International Prognostic Scoring System) МДС [16], больных распределили следующим образом: группа низкого риска — 7, промежуточного-1 риска — 7, промежуточного-2 риска — 3 и высокого риска — 7. Для упрощения дальнейшей статистической обработки полученных результатов всех пациентов распределили на 2 группы: 1-я — больные с низким и промежуточным-1 риском прогрессирования в ОЛ, 2-я — с промежуточным-2 и высоким риском прогрессирования.

Материалами исследования в данной работе являлись аспираты К.М. Полученный биологический материал разделяли в градиенте плотности фиколла («ПанЭко», Россия) c целью получения мононуклеарной фракции клеток, из которой выделяли тотальную РНК с помощью Trizol-reagent («MRC», США). Все процедуры подробно описаны ранее [17].

Для синтеза кДНК в ходе обратной транскрипции использовали 1 мкг тотальной РНК, 1 мкл «random 6» вырожденных гексапраймеров («Синтол», Россия), 2,5 мМ смесь dNTP («MBI Fermentas», Литва), 0,4 ед. ингибитора РНКаз («MBI Fermentas», Литва), 2 ед. обратной транскриптазы M-MuLVplus («Синтол», Россия). Объем смеси составлял 25 мкл. Синтез проводили на амплификаторе Терцик («ДНК-технология», Россия) при температуре 42 °C, 50 мин с предварительной преинкубацией в течение 10 мин при температуре 25 °C. Реакцию останавливали при помощи нагревания до 70 °C в течение 10 мин.

Полимеразную цепную реакцию в реальном времени (ПЦР-РВ) проводили на амплификаторе Bio-Rad CFX («Bio-Rad», США) с использованием интеркалирующего красителя EvaGreen («Biotium», США) по следующей схеме: 95 °C в течение 5 мин — 1 цикл и затем 39 циклов: денатурация — 95 °C, 20 с; отжиг праймеров — 59 °C, 25 с; синтез — 72 °C, 20 с. Каждый образец исследован троекратно. Нуклеотидные последовательности праймеров приведены в таблице.

Для нормирования данных использовали экспрессию гена 60S субъединицы рибосомы RPL27. Относительный уровень экспрессии каждого гена определяли по формуле 2^∆Ct: [∆C_t=C_t(RPL27) – C_t (исследуемого гена), где C_t — минимальный пороговый цикл гена в экспоненциальной фазе амплификационной кривой].

Статистическую обработку данных проводили, используя программное обеспечение GraphPad Prism 5.02. Результаты представлены, как М±ЕМ или m (где М — среднее арифметическое выборки, ЕМ — стандартная ошибка средней, m — медиана). Статистическую значимость определяли с помощью критерия t Стьюдента при значении р<0,05. Корреляционные зависимости определяли с помощью критериев Пирсона (r) или Спирмена (R). Расчет кривых ОВ проводили с помощью метода Каплана—Майера, а статистически значимые различия по выживаемости определяли с помощью теста Мантела—Кокса.

Мы определили уровни экспрессии гена VEGF-A, а также генов рецепторов VEGFR1 и VEGFR2 в мононуклеарных фракциях клеток, полученных от 24 пациентов с МДС. Наши данные показали, что уровни экспрессии генов VEGF-A, VEGFR1 и VEGFR2 в группе больных с МДС значительно различались. Экспрессия гена фактора роста VEGF-A оказалась выше уровней экспрессии генов VEGFR1 и VEGFR2 у 22 (91,6%) из 24 пациентов. Наиболее низкими были индивидуальные значения экспрессии гена рецептора VEGFR2 (0,00003—0,016±0,00066). При этом уровень экспрессии гена VEGFR1 был в 2,36 раза выше (p<0,01) аналогичного показателя для гена VEGFR2 (рис. 1).

Поскольку риск трансформации МДС в ОЛ является одним из ключевых моментов при данном заболевании, мы разделили пациентов на 2 группы, в зависимости от степени риска прогрессирования заболевания. Эти группы достоверно различались по медиане ОВ. У пациентов 1-й группы медиана ОВ более чем в 3 раза выше (p<0,01), чем у пациентов 2-й группы (рис. 2).

Далее мы проанализировали, существуют ли различия в уровнях экспрессии генов VEGF-A, VEGFR1 и VEGFR2 у пациентов 1-й и 2-й групп. Мы не обнаружили статистически значимой разницы в экспрессии исследованных генов в этих группах (рис. 3). Тем не менее во 2-й группе уровни экспрессии генов VEGF-A и VEGFR1 оказались выше на 21 и 19,6% соответственно, чем в 1-й. При этом экспрессия гена рецептора VEGFR2 у пациентов с промежуточным-2 и высоким риском прогрессирования (2-я группа), напротив, оказалась ниже на 67%, чем у пациентов с промежуточным-1 и низким риском (1-я группа). Однако описанные различия по уровням экспрессии генов VEGF-A, VEGFR1 и VEGFR2 между двумя группами не достигали статистической значимости.

Вместе с тем мы обнаружили положительную корреляцию между уровнем экспрессии гена VEGF-A и количеством бластных клеток у больных (p<0,05; r=0,49), тогда как для генов VEGFR1 и VEGFR2 такой корреляции не обнаружено. В дополнение к этому мы выявили, что экспрессия гена фактора роста VEGF-A в двух группах статистически значимо коррелировала с экспрессией гена рецептора VEGFR1 (p<0,05; r=0,46) в отличие от гена рецептора VEGFR2, для которого такой корреляции с экспрессией VEGF-A не обнаружено (p=0,08; r=0,36).

Корреляционный анализ связей между показателями ОВ 24 пациентов, включенных в это исследование, и уровнями экспрессии генов VEGF-A, VEGFR1 и VEGFR2 показал, что экспрессия всех 3 генов обратно коррелировала с ОВ больных, но статистически значимый характер (r=– 0,5; p<0,05) имела лишь для гена VEGFR1. Действительно, приняв в качестве дифференцирующего критерия только индивидуальные значения экспрессии гена VEGFR1 у каждого пациента, отклоняющиеся от медианного значения (m=0,0047), и подразделив, таким образом, общую группу больных на подгруппу VEGFR1_low (уровень экспрессии VEGFR1 <m) и подгруппу VEGFR1_high (уровень экспрессии VEGFR1 >m), мы обнаружили статистически значимые различия между кривыми ОВ этих двух подгрупп (p<0,05). Так, медиана общей продолжительности жизни для подгруппы VEGFR1_low составила 94 мес, а для подгруппы VEGFR1_high — 29 мес (рис. 4).

Разработке новых подходов и алгоритмов в диагностике различных злокачественных новообразований посвящено значительное число работ, выполненных в последние десятилетия в области экспериментальной онкологии. Исследуемые в них изменения тех или иных молекулярных маркеров позволяют выявлять характерные различия между пулами неопластических и нормальных клеток, что важно для диагностики. В то же время изменения, специфичные лишь для опухолевых клеток, из которых сформирована определенная злокачественная опухоль, могут быть соотнесены с клинически важными для нее показателями и, таким образом, эти изменения могут быть прогностически значимыми.

В этой работе мы исследовали количественное значение экспрессии гена фактора роста эндотелия сосудов VEGF-A и генов его рецепторов — VEGFR1 и VEGFR2 в качестве возможных диагностических и прогностических факторов для пациентов с различными вариантами МДС.

Известно, что новообразование кровеносных сосудов при участии VEGF-A и его рецепторов VEGFR1 и VEGFR2 является ключевым в стимуляции опухолевого роста и метастазирования [18]. Однако активация сигнальных каскадов, запускаемых лигандом VEGF-A и рецепторами VEGFR1 и VEGFR2, не ограничивается только процессом неоваскуляризации, но также может индуцировать различные митогенные и антиапоптотические клеточные программы [19]. В связи с этим мы предположили, что связанная с функционированием сигнальных систем VEGF-A—VEGFR1 и/или VEGF-A—VEGFR2 гиперэкспрессия генов VEGF-A/VEGFR1/VEGFR2 может играть определенную роль при МДС. Сравнение уровней экспрессии генов VEGFR1 и VEGFR2 показало, что уровень экспрессии гена VEGFR1 статистически значимо превалировал над экспрессией гена VEGFR2 в общей группе больных. Вероятно, это указывает на то, что система VEGF-A—VEGFR1, но не VEGF-A—VEGFR2 является доминирующей у обследованных нами пациентов и именно она может отвечать за трансляцию и ангиогенных, и пропролиферативных сигналов, способных индуцировать прогрессирование заболевания. Наши данные частично согласуются с рядом работ, в которых определено негативное прогностическое значение увеличенной экспрессии фактора роста VEGF-A при МДС [14, 20].

Мы не выявили статистически значимых различий по уровням экспрессии генов VEGF-A и VEGFR1 между 1-й и 2-й группами, различающимися по степени риска прогрессирования заболевания. Изменения экспрессии гена VEGFR2 между этими группами были более выраженными. Однако уровень экспрессии этого гена у больных крайне низкий. При этом мы отметили более низкую экспрессию гена VEGFR2 во 2-й группе по сравнению с 1-й, которая наблюдалась на фоне более высокой экспрессии генов VEGF-A и VEGFR1 в этой же группе. Мы также обнаружили статистически значимые прямые корреляции между экспрессией VEGF-A и количеством бластных клеток у обследованных пациентов, а также уровнями экспрессии генов VEGF-A и VEGFR1, но не между VEGF-A и VEGFR2.

Выявленные корреляции в изменении экспрессии генов VEGF-A/VEGFR1/VEGFR2, вероятно, указывают на то, что зависимая от VEGF-A сигнальная система может играть важную роль в злокачественной эволюции МДС и реализация сигнала фактора роста VEGF-A при МДС происходит главным образом через рецептор VEGFR1, но не VEGFR2. F. Wimazal и соавт. [21] также обнаружили прямую корреляцию между экспрессией гена VEGF-A и количеством незрелых миелоидных клеток (бластов и моноцитарных предшественников, т. е. с более высоким риском трансформации). Так, более высокие уровни белка VEGF-A выявлены у больных с РАИБ, РАИБ с трансформацией в ОЛ и больных хроническим миеломоноцитарным лейкозом по сравнению с контрольной группой.

В нашей работе только уровень экспрессии гена VEGFR1 статистически значимо обратно связан с ОВ всех 24 пациентов, включенных в это исследование, но не экспрессия VEGF-A и VEGFR2. Ранее у 19 первичных больных ММ мы также выявили, что увеличенная коэкспрессия генов VEGF-A и VEGFR1 отмечалась у больных с достоверно более высоким уровнем инфильтрации КМ плазматическими клетками, большей концентрацией опухолевого парапротеина в сыворотке крови и меньшей медианой ОВ [22].

Проведен анализ экспрессии генов VEGF-A, VEGFR1 и VEGFR2 в мононуклеарной фракции клеток больных с МДС. Крайне низкий уровень экспрессии гена, кодирующего рецептор VEGFR2, по-видимому, указывает на то, что зависимый от VEGF-A сигнальный путь может реализовываться в этих клетках через взаимодействие с рецептором VEGFR1. Не выявлено статистически значимых различий по экспрессии генов между группами больных с различной степенью риска прогрессирования заболевания. Вместе с тем обнаружена статистически значимая зависимость между ОВ больных и уровнем экспрессии гена VEGFR1.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.