Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) относится к заболеваниям с неуклонно прогрессирующим течением, имеющим широкое распространение среди людей трудоспособного возраста [1—3].

Важным фактором риска развития ХОБЛ является курение. Установлено, что только 15—20% всех курильщиков заболевают ХОБЛ. Риск развития болезни повышается до 95% у лиц с табачной зависимостью на фоне наследственной отягощенности [1, 3, 4]. Особое значение отводится генетическому полиморфизму генов, кодирующих группу АВ0, α1-антитрипсин, витамин D-связывающий белок, α2-макроглобулин, цитохром Р-450А1 [3, 5—7].

В настоящее время большинство исследований направлено на изучение структурных и функциональных изменений слизистой оболочки бронхов (СОБ) у больных ХОБЛ, развивающейся на фоне постоянного воздействия табачного дыма. В то же время в России и за рубежом только небольшие группы исследователей занимаются изучением сравнительной характеристики морфометрических показателей СОБ у курильщиков, страдающих и не страдающих ХОБЛ, для выявления механизмов ремоделирования бронхиальной стенки и факторов резистентности к развитию ХОБЛ.

Цель исследования — выявить тканевые, клеточные и молекулярные предикторы, приводящие к развитию ХОБЛ у курильщиков, на основании морфометрического анализа бронхобиоптатов.

Проведено одномоментное исследование у 115 курильщиков в возрасте от 40 до 60 лет (58,3±3,24 года), среди которых преобладали мужчины (90,9%). На основании результатов спирометрического исследования пациентов разделили на 2 группы: 1-я — 32 «здоровых» курильщика без ХОБЛ (группа сравнения); 2-я — 83 курильщика с верифицированным диагнозом ХОБЛ (основная группа).

Критериям включения в исследования стали возраст от 40 до 60 лет (58,3±3,24 года); длительность курения не менее 20 лет; интенсивность курения 22 (20; 45) пачко-года; для основной группы — верифицированный диагноз ХОБЛ.

Критерии исключения из исследования: нежелание пациента принимать участие в исследовании, отсутствие информированного согласия, наличие тяжелых сопутствующих заболеваний, злокачественных новообразований или обострение хронических болезней, наличие других заболеваний бронхолегочной системы (бронхиальной астмы, бронхоэктатической болезни, буллезной эмфиземы легких, кисты легких, асбестоза, резекции части легких или их трансплантация, туберкулеза легких, травмы грудной клетки), прием психотропных и наркотических препаратов.

До проведения любых процедур, связанных с исследованием, получено письменное информированное согласие больного (одобрено локальным комитетом по этике ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России г. Томска № 2833/1 от 31.11.11).

Бронхоскопию больным выполняли по стандартной методике гибким фиброскопом (BF1T20, «Olympus Corporation», Япония) с соблюдением всех необходимых условий, натощак, в утренние часы, в условиях фибробронхоскопического кабинета. Бронхобиоптаты (3—4 фрагмента) получали методом щипковой биопсии слизистой оболочки правого среднедолевого бронха. Материал фиксировали в 10—12% нейтральном растворе формалина, проводили по спиртам возрастающей концентрации и заливали в парафин по стандартной методике.

Обзорную микроскопию и морфометрию осуществляли на микропрепаратах, окрашенных гематоксилином и эозином. Для анализа выраженности фиброза использовали окраску пикрофуксином по Ван-Гизону. Морфологию базофилов оценивали с помощью сочетанной окраски бронхобиоптатов основным коричневым и прочным зеленым по методу, предложенному В.Ю. Голофеевским, С.Г. Щербак [7].

Биоптаты СОБ изучали с использованием бинокулярного светового микроскопа Karl Zeis «Axioskop 40 FL». При обзорной световой микроскопии в СОБ оценивали наличие воспалительных, дисрегенераторных (плоскоклеточная метаплазия, пролиферация базальных и бокаловидных клеток) и фиброзных изменений.

Морфометрический анализ СОБ в обследуемых группах пациентов проводили с помощью компьютерной программы ImageJ 1.43 (режим доступа http://wwwrsb.info.nih.gov/ij/).

С помощью метода точечного счета Автандилова с использованием Plugins «Grid» в бронхобиоптатах подсчитывали удельные объемы — УО (мм³/мм³) следующих структур: покровного эпителия (VVпэ), отдельных клеточных форм (VVрэ, VVбэ, VVбзэ), соединительной ткани (VVст), желез (VVжел), микрососудов (VVмс). Используя окуляр-микрометр, определяли диаметр сосудов, высоту эндотелия и эпителиального пласта, а также толщину базальной мембраны [7].

При помощи Plugins «Cell» программы ImageJ в 1 мм² собственной пластинки (СП) СОБ подсчитывали плотность воспалительного инфильтрата и различных клеточных популяций (макрофагов, лимфоцитов, полиморфно-ядерных лейкоцитов), общее число их межэпителиальных форм.

В 1 мм² среза определяли плотность эозинофилов и базофилов с выделением разных клеточных форм. В целях оценки эпителиально-стромальных взаимоотношений изучали содержание в 1 мм² клеток стромы, к которым относили фибробласты.

Статистическую обработку данных выполняли при помощи пакета программ Statistica 6.0. Результаты представляли в виде медианы (Me), меру рассеяния — в виде межквартильного интервала (25-й процентиль; 75-й процентиль). Для оценки различий в попарно несвязанных выборках использовали метод Манна—Уитни.

При проведении морфометрического исследования бронхобиоптатов СОБ у пациентов с ХОБЛ по сравнению с группой сравнения обнаружено статистически значимое увеличение ряда показателей (табл. 1).

У курильщиков с ХОБЛ в СОБ наблюдалась выраженная структурная дезорганизация эпителиального пласта, проявляющаяся атрофией реснитчатых клеток, бокаловидноклеточной гипоплазией и плоскоклеточной метаплазией. Реснитчатые клетки СОБ у пациентов с ХОБЛ на фоне курения уменьшены в размерах, в эпителиальном пласте уменьшено число бокаловидных экзокриноцитов (соотношение с реснитчатыми клетками 1:6, 1:7). В бронхобиоптатах у курящих пациентов с ХОБЛ в 12,2% случаев участки атрофии эпителия и желез СОБ чередовались с очагами плоскоклеточной метаплазии.

В биоптатах СОБ больных ХОБЛ в отличие от «здоровых» курильщиков зарегистрированы большие высота эпителиального пласта и объемная плотность покровного эпителия, преимущественно за счет базальных эпителиоцитов, что свидетельствует об изменении регенерации эпителиального пласта (см. табл. 1).

Плоскоклеточная метаплазия, развивающая у курящих пациентов с ХОБЛ, нами расценивается как пролиферативно-клеточный вариант реорганизации бронхиального эпителия, связанный с истощением структурно-метаболических резервов клетки и снижением их белково-синтетической функции [5, 8, 9].

При длительно протекающей ХОБЛ плоскоклеточная метаплазия и атрофия бронхиального эпителия в СОБ являются финальными стадиями в цикле возможных превращений реснитчатого эпителия. Эти процессы относятся к компенсаторным, хотя в основном осуществляются за счет минимизации функции реснитчатых эпителиоцитов [8, 9].

При этом, по данным T. Lapperre и соавт. [10], выраженность метаплазии, а также пролиферативные изменения эпителия бронхов статистически значимо ниже у пациентов с ХОБЛ, прекративших курение.

Важно отметить, что у обследуемых пациентов с ХОБЛ в СОБ выявлено статистически значимое (р=0,006) утолщение базальной мембраны за счет фиброза СП СОБ (2,73 (1,36—3,25) мкм в группе ХОБЛ и 1,49 (0—2,61) мкм в группе сравнения) с одновременным снижением относительного объема капилляров, что связано с развитием сосудистого ремоделирования бронхиальной стенки и отражается в эпителиально-стромальной дисфункции бронхов (см. рисунок).

Полученные нами факты отражаются и в других научных исследованиях [11, 12]. По данным N. Köktürk и соавт. [12], у пациентов с ХОБЛ имеется незначительное утолщение базальной мембраны, которое менее выражено, чем при бронхиальной астме. В то же время по данным A. Soltani и соавт. [13] в сравнительном исследовании курильщиков с ХОБЛ, больных ХОБЛ, отказавшихся от курения, и «здоровых» курильщиков не получено достоверных различий по толщине базальной мембраны, однако наблюдалась ее разволокнение с перестройкой микроциркуляторного русла у курильщиков с ХОБЛ [13].

В последние годы возрастает число исследований, направленных на изучение проблемы расстройств микроциркуляции при ХОБЛ как звена патогенеза заболевания [5, 6, 14]. Так, по данным Н.А. Кузубовой и соавт. [6], у больных ХОБЛ нарушения вазорегулирующей функции эндотелия возникают уже на ранней стадии заболевания и нарастают по мере прогрессирования патологического процесса, что нередко сопровождалось повышением уровня эндотелина-1 в плазме крови и приводило к формированию хронического легочного сердца. Наши морфометрические данные подтверждают дисциркуляторные расстройства, наблюдаемые у курильщиков с ХОБЛ, что отражалось в уменьшении УО микропиноцитозных везикул на люминальной поверхности эндотелиоцитов, диаметра и размера гранул Вейбеля—Паладе (табл. 2). В связи с тем что в гранулах Вейбеля—Паладе находится и накапливается множество биологически активных веществ (эндотелин-1, P-селектин, фактор Виллебранда и др.), массивное высвобождение содержимого гранул у курильщиков с ХОБЛ может приводить к резкому увеличению вазомоторного тонуса и усилению тромбообразования [9, 15, 16]. Этот факт нашел отражение в увеличении числа сосудов закрытого типа с ультраструктурными признаками дисфункции эндотелия, что приводит к нарушению перфузии через микрососуды, блокаде транскапиллярного обмена, обнаруженное нами у пациентов основной группы.

В ходе исследования получены данные о морфометрической характеристики клеток воспалительного инфильтрата СОБ при ХОБЛ и у «здоровых» курильщиков. У пациентов с ХОБЛ суммарная плотность клеточного инфильтрата в 1 мм² СОБ при различных стадиях заболевания статистически значимо (р<0,001) превышала показатели группы сравнения: 276,06 (215,37—323,21) при ХОБЛ и 150,41 (47,05—249,60) в группе сравнения.

Увеличение клеточности воспалительного инфильтрата в СП СОБ у курильщиков с ХОБЛ связано как с клетками, поступающими в бронхиальную стенку из кровеносного русла, так и постоянно присутствующими клеточными элементами соединительной ткани [17].

Плотность клеточного инфильтрата увеличивалась за счет полиморфно-ядерных лейкоцитов — нейтрофилов, макрофагов, плазмоцитов с одновременным увеличением общего числа межэпителиальных форм (табл. 3, 4). По данным литературы, увеличение плотности нейтрофилов прослеживается на всех стадиях ХОБЛ с нарастанием на более тяжелых [18, 19], в том числе по сравнению с таковыми у курильщиков без ХОБЛ [20]. В то же время плотность макрофагов, плазмоцитов неоднородна в исследуемых группах. Согласно данным A. Di Stefano и соавт. [21, 22] в СОБ курильщиков без ХОБЛ и при начальных стадиях ХОБЛ преобладают макрофаги и Т-лимфоциты, преимущественно популяции CD8⁺.

Данные B. Willemse и соавт. [20] коррелируют с полученными нами результатами в отношении плазматических клеток в СОБ: в группе курильщиков с ХОБЛ данный показатель достоверно выше, чем в группе «здоровых» курильщиков, что подчеркивает важную роль данной клеточной популяции в патогенезе ХОБЛ и требует дальнейшего изучения (см. табл. 3) [23].

При проведении морфометрического исследования плотности базофилов и их функциональной активности у пациентов с ХОБЛ по сравнению с группой сравнения нами обнаружено статистически значимое (р=0,002) увеличение плотности этих клеточных популяций в 1 мм² среза с одновременным повышением низко- и умеренно гранулированных форм (табл. 5). Аналогичные результаты получены при оценке среднего цитохимического коэффициента при ХОБЛ — 2,39 (2,32—2,50), в группе сравнения — 6,30 (2,36—2,77).

Данный факт отчетливо свидетельствует о более высокой функциональной активности популяции базофилов у пациентов с ХОБЛ и их роли в поддержании гиперергического патологического воспалительного процесса в бронхиальной стенке [24].

Кроме того, в исследованиях A. Soltani и соавт. [25] показана достоверная роль базофилов в стимулировании неоангиогенеза под воздействием табачного дыма у пациентов с ХОБЛ.

Известно, что базофилы высвобождают большое количество биологически активных веществ, среди которых трансформирующий β1-фактор роста, иммунорегуляторное влияние которого сопровождается активацией пула Т-лимфоцитов с повышением их цитотоксического эффекта. Помимо оказания непосредственного цитотоксического действия на клетки бронхиального эпителия лимфоциты вырабатывают α-фактор некроза опухоли, который усиливает высвобождение IL-8 из макрофагов [8, 26—28]. Под влиянием данного интерлейкина происходит активация нейтрофилов, плотность которых в СОБ у курильщиков с ХОБЛ преобладала над другими популяциями клеток и сочеталась с увеличением числа межэпителиальных форм.

Известно, что маркерным ферментом, который высвобождается из гранул нейтрофилов, является нейтрофильная эластаза, которая может разрушать биологические молекулы, следствием чего являются дисфункция внутриклеточных органоидов в эпителиальных клетках и последующее развитие регенераторно-пластического дефицита, что регистрировалось как в нашей работе, так и в ряде подобных исследований [8, 16, 29].

Помимо оказания деструктивного действия этот фермент стимулирует структурную перестройку дыхательных путей, что реализуется посредством высвобождения профиброзных факторов роста FGF-1, FGF-2, которые стимулируют пролиферацию фибробластов и наработку ими труднодеградируемого коллагена, формирующего фиброз СП СОБ, что обнаружено нами у курильщиков с ХОБЛ и ассоциировалось с необратимостью обструкции бронхов [2, 26, 30].

У курильщиков без признаков ХОБЛ в СОБ регистрировались структурные изменения компенсаторного характера, которые носили адаптивный характер без признаков ремоделирования бронхиальной стенки.

У курящих пациентов с ХОБЛ в бронхобиоптатах выявлялись морфологические признаки нарушения гемодинамики, воспалительные изменения, приводящие к плоскоклеточной метаплазии эпителия бронхов, и бокаловидноклеточная гипоплазия с фиброзом бронхиальной стенки.

Необратимость обструкции бронхов, наблюдаемая нами у курильщиков с ХОБЛ, ассоциирована с дисфункцией эндотелия и регенераторно-пластической недостаточностью эпителиальных клеток, приводящих к структурной перестройке бронхиального дерева.

Конфликт интересов отсутствует.