АИ — атеротромботический инсульт

АЧТВ — активированное частичное тромбопластиновое время

ДИ — доверительный интервал

ИИ — ишемический инсульт

ЛПВП — липопротеины высокой плотности

ЛПНП — липопротеины низкой плотности

ЛПОНП — липопротеины очень низкой плотности

МНО — международное нормализованное отношение

ОХС — общий ХС

ОШ — отношение шансов

ПТИ — протромбиновый индекс

ТГ — триглицериды

ХС — холестерин

ЭхоКГ — эхокардиография

CETP — белок — переносчик эфиров ХС

LPL — липопротеинлипаза

Ишемический инсульт (ИИ) — распространенное мультифакторное заболевание, в развитии которого играют роль генетические и средовые факторы. В настоящее время идентифицировано множество генов — кандидатов ИИ, однако во многих случаях результаты исследований оказались противоречивыми [1—9]. Известно, что основной причиной ИИ служит атеросклероз мозговых сосудов, в развитии которого ведущую роль играют нарушения липидного обмена. В этой связи гены — регуляторы липидного обмена рассматриваются как потенциальные гены-кандидаты при тестировании наследственной предрасположенности к И.И. Одними из ключевых генов липидного обмена являются гены белка — переносчика эфиров холестерина (CETP) и липопротеинлипазы (LPL).

CETP участвует в транспорте эфиров холестерина (ХС) из липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) в липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП) и липопротеины низкой плотности (ЛПНП) [10], тем самым регулируя содержание ХС ЛПВП в крови. Установлено, что уровень и активность CETP связаны с уровнем ЛПВП в плазме крови [11], а уровень ХС в составе ЛПВП напрямую влияет на риск развития атеросклероза [12].

LPL играет центральную роль в метаболизме липидов, участвуя в гидролизе триглицеридов (ТГ) и регулируя метаболизм ХС ЛПВП [13]. Различные полиморфизмы, обнаруженные в гене LPL [14], уменьшают или увеличивают активность фермента LPL, тем самым изменяя уровень ХС ЛПВП [13]. Функциональный полиморфизм HindIII гена LPL связан с уровнем ТГ, ЛПВП и уровнем общего ХС (ОХС) в плазме крови [15].

Данные литературы относительно вклада полиморфизма Taq1B гена CETP и полиморфизма HindIII гена LPL в формирование риска развития ИИ противоречивы и немногочисленны [3—7,16]. В России проведено лишь два исследования по изучению ассоциации полиморфизма HindIII гена LPL с риском развития ИИ (в якутской и русской популяциях) [6—7], тогда как исследований полиморфизма Taq1B гена CETP не проводилось. Различия в результатах генетических исследований генов CETP и LPL при сосудисто-мозговых заболеваниях могут быть связаны с генетической гетерогенностью изученных популяций. Следует также отметить, что в большинстве выполненных исследований анализировалась взаимосвязь данных генов с риском развития ИИ без учета его клинико-патогенетических типов (атеротромботический, кардиоэмболический, лакунарный, гемодинамический), в то время как гены липидного обмена занимают важное место в патогенезе ИИ атеротромботического типа [3].

Целью нашего исследования стало изучение связи полиморфизма HindIII гена LPL и полиморфизма Taq1B гена CETP с риском развития атеротромботического инсульта (АИ) в русской популяции.

Материалом для исследования послужила выборка неродственных индивидуумов русской национальности, проживающих в Курской области (все уроженцы Центральной России), общей численностью 832. Проведение исследования одобрено региональным этическим комитетом Курского государственного медицинского университета. Всего обследованы 249 пациентов с АИ, находившихся на стационарном лечении в неврологических отделениях Курской областной клинической больницы и городской больницы скорой медицинской помощи Курска в период с 2007 по 2010 г. [8—9]. Кроме того, обследованы 168 пациентов, проходивших лечение в Региональном сосудистом центре Курской областной клинической больницы в 2012—2013 гг. В данное исследование мы включили только пациентов с атеротромботическим типом И.И. Диагноз А.И. устанавливался квалифицированными неврологами на основании данных неврологического статуса и подтверждался результатами магнитно-резонансной томографии головного мозга. При подозрении на наличие источника кардиоэмболии по клинической симптоматике пациентам проводили электрокардиографию и трансторакальную эхокардиографию (ЭхоКГ), в отсутствие изменений на электро- и эхокардиограмме, выполняли холтеровское мониторирование или трансэзофагеальную ЭхоКГ. Пациентов с электрокардиографически диагностированной фибрилляцией предсердий, а также с хронической или пароксизмальной фибрилляцией предсердий в анамнезе исключали из исследования. В исследование также не включали пациентов с диагностированными пороками сердца, клапанов сердца, крупных магистральных сосудов, пациентов с искусственными водителями ритма, а также перенесших инфаркт миокарда ранее чем за 6 мес до госпитализации. Критерием исключения из исследования также были хронические болезни почек, системные заболевания соединительной ткани, эндокринные, онкологические и другие заболевания, которые могли быть причиной острого нарушения мозгового кровообращения. Все пациенты с АИ отмечали наличие гипертонической болезни в анамнезе и/или получали гипотензивную терапию. Контрольную группу составили 415 относительно здоровых добровольцев с нормальным уровнем артериального давления. Формирование контрольной группы осуществляли в 2 этапа: с 2007 по 2010 г. [17] и с 2012 по 2013 г. Средний возраст больных группы АИ (220 мужчин, 197 женщин) составил 61,42±10,09 года, контрольной группы (222 мужчины, 193 женщины) — 61,84±10,03 года.

Для проведения молекулярно-генетических и биохимических исследований у всех обследуемых брали образцы венозной крови. Геномную ДНК выделяли стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции. В рамках исследования проводили генотипирование двух полиморфизмов: HindIII (rs320) гена LPL, приводящего к замене тимина гуанином в 8-м интроне (T+495G), и Taq1B гена CETP (rs708272), приводящего к замене гуанина аденином в 1-м интроне (+279G>A). Генотипирование проводили методом полимеразной цепной реакции в реальном времени путем дискриминации аллелей с помощью TaqMan-зондов на амплификаторе CFX96 Bio-Rad (США) с использованием коммерческих наборов реактивов TaqMan SNP Genotyping Assays («Applied Biosystems», США). Анализ липидного состава крови включал определение уровня ОХС, ТГ после 14-часового периода ночного голодания и проводился ферментативным способом на биохимическом анализаторе Flexor XL («Vital Scientific», Нидерланды). Анализ показателей свертывающей системы крови, включающий протромбиновый индекс (ПТИ), международное нормализованное отношение (МНО), активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) проводили на автоматизированном анализаторе гемостаза STA Compact («Roche Diagnostics», Швейцария) клоттинговым методом.

Для оценки ассоциаций аллелей и генотипов с риском развития ИИ использовали критерий χ² и отношение шансов (ОШ) с 95% доверительным интервалом (ДИ). Биохимические параметры оценивали на нормальность распределения с помощью теста Колмогорова—Смирнова. Для оценки влияния изучаемых полиморфизмов на биохимические показатели (ОХС, ТГ, ПТИ, МНО, АЧТВ) использовали непараметрический дисперсионный анализ Крускала—Уоллиса. Различия при р<0,05 рассматривались как статистически значимые. Статистическая обработка данных проводилась с использованием программных пакетов Statistica for Windows 8.0 («StatSoft») и Excel 2007 («Microsoft»).

Отклонения частот аллелей и генотипов полиморфизма Taq1B гена CETP от популяционного равновесия Харди—Вайнберга в группе больных ИИ и контроле не наблюдалось (р>0,05). Однако выявлены отклонения от равновесия Харди—Вайнберга в группе больных АИ по полиморфному маркеру HindIII гена LPL за счет уменьшения наблюдаемой гетерозиготности (р<0,01).

Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов исследуемых полиморфизмов представлен в табл. 1. Показано, что различия по частотам аллелей и генотипов по полиморфному варианту Taq1B гена CETP между группами больных АИ и здоровых отсутствовали. В то же время у больных АИ частота гетерозиготного генотипа +495TG гена LPL (33,1%) оказалась ниже, чем в контроле, — 41,2% (ОШ 0,71 при 95% ДИ от 0,53 до 0,94; р=0,02). При стратифицированном анализе ассоциаций частот аллелей и генотипов с риском развития АИ в зависимости от пола (табл. 2) выявлено отсутствие различий по частотам аллелей и генотипов исследуемых полиморфизмов у больных АИ женщин. Однако у больных АИ мужчин наблюдалось преобладание гомозигот по вариантному аллею +495GG полиморфизма HindIII гена LPL (ОШ 2,06 при 95% ДИ от 1,03 до 4,14; р=0,04), тогда как гетерозиготный генотип +495TG чаще встречался в контрольной группе (ОШ 0,66 при 95% ДИ от 0,45 до 0,97; р=0,04).

На следующем этапе проанализированы ассоциации полиморфизма HindIII гена LPL с показателями липидного обмена и коагулограммы у больных АИ в зависимости от генотипов (табл. 3). В связи с тем что изучаемые признаки не починялись закону о нормальном распределении (р<0,05), для оценки влияния генотипов на исследуемые биохимические показатели использовали непараметрический дисперсионный анализ Крускала—Уоллиса. Установлено, что полиморфизм HindIII гена LPL ассоциирован (р=0,01) с ПТИ. На рисунке видно, что наиболее высокие ПТИ наблюдались у носителей вариантного генотипа +495GG гена LPL.

Исследована ассоциация полиморфизмов Taq1B гена CETP и HindIII гена LPL с риском развития АИ в русской популяции. Мы не обнаружили взаимосвязь полиморфизма Taq1B гена CETP и риска развития АИ, что согласуется с результатами исследователей, выполненных в других популяциях [4, 18]. В то же время нами выявлена ассоциация полиморфизма HindIII гена LPL c риском развития АИ.

Ген LPL локализован на хромосоме 8p22, состоит из 10 экзонов и имеет более 100 мутаций [14]. Наиболее распространенный полиморфизм HindIII в гене LPL приводит к трансверсии (замене тимина гуанином) в 8-м интроне. Полиморфизм локализован в некодирующей части гена и связан с концентрацией ТГ [19] и ХС ЛПВП [13] в плазме крови. Возможно, наблюдаемые функциональные эффекты полиморфизма связаны с тем, что он тесно сцеплен с другим, функционально значимым полиморфизмом Ser447Ter, локализованном в 9-м экзоне [20] и приводящем к снижению активности фермента LPL [20].

Результаты проведенных исследований взаимосвязи полиморфизма HindIII гена LPL и риска развития ИИ противоречивы. P. Huang и соавт. [16] на выборке 113 пациентов с ИИ из Швеции не обнаружили взаимосвязи изучаемого генетического маркера и риска развития ИИ. В исследовании, проведенном Y. Shimo-Nakanishi и соавт. [3], обнаружен протективный эффект аллеля G относительно риска развития АИ в японской популяции. Полученные нами результаты согласуются с данными другого проведенного в России исследования, выполненного в популяции якутов [6], в котором обнаружена ассоциация вариантного аллеля G с повышенным риском развития ИИ у женщин. Однако согласно полученным нами результатам полиморфизм HindIII (T+495G) гена LPL связан с повышенным риском развития АИ у мужчин. Известно, что существуют значительные половые различия по уровню липидов и липопротеинов в плазме крови [21], а также во влиянии генотипов на распределение липидов в плазме крови [22]. Подобные различия могут быть связаны с влияниями половых гормонов на активность LPL в тканях сердечно-сосудистой системы [23]. В частности, в промоторной области гена LPL существует последовательность, через которую осуществляется опосредованная эстрогенами регуляция экспрессии гена LPL [24].

При анализе взаимосвязи полиморфизма HindIII в гене LPL с показателями липидного обмена и показателями свертывающей системы крови нами обнаружено выраженное влияние данного генетического маркера на ПТИ — важный показатель активности протромбинового комплекса, а именно факторов свертывания крови VII, V, X и II. В литературе имеются данные о том, что LPL активирует фактор свертывания VII (FVII, проконвертин) через собственный патогенетический путь [25]. Показано, что липолиз ЛПОНП, хиломикронов и содержащихся в них ТГ под действием LPL приводит к генерации отрицательного заряда на поверхности липопротеида, который активирует FVII [25—26]. Обнаруженная взаимосвязь между концентрацией ХС ЛПВП отражает активность LPL и базальный уровень активированного фактора свертывания FVIIа [27].

Таким образом, в рамках проведенного исследования впервые установлена ассоциация полиморфизма HindIII гена LPL с риском развития АИ в популяции жителей Центральной России, а также выявлена связь данного полиморфизма с ПТИ, демонстрируя патогенетическую сопряженность нарушений липидного обмена и свертывающей системы крови при формировании ишемической болезни мозга. Определенным ограничением нашего исследования является узкий спектр проанализированных ДНК-маркеров, в связи с чем нельзя исключить возможность влияния других полиморфизмов генов LPL и CETP, которые, также могут вносить вклад в генетическую компоненту подверженности А.И. Несомненно, полученные нами результаты обусловят необходимость проведения подтверждающих исследований в независимых популяциях мира. Однако, учитывая, что АИ представляет собой многофакторное и в значительной степени генетически гетерогенное заболевание, степень влияния даже известных «генов предрасположенности» на его патогенез может существенно отличаться в популяциях, имеющих различную гаплотипическую структуру и специфику в спектре влияния средовых факторов риска.