ВП — внесуставные проявления

ДИ — доверительный интервал

ММР — матриксные металлопротеиназы

ОШ — отношение шансов

РА — ревматоидный артрит

РУ — ревматоидные узелки

Несмотря на многолетние фундаментальные исследования, патогенез ревматоидного артрита (РА) остается не изученным. В литературе широко обсуждается вопрос о мультифакторной природе данного заболевания, в которой важное место занимают генетические, внешнесредовые, иммунологические, гормональные, инфекционные и другие факторы [1, 2]. При развитии РА формируется особый тип воспаления, при котором немаловажную роль играют деструктивные процессы в соединительной ткани. В настоящее время именно в системе протеолиза ведется активный поиск маркеров деструкции соединительной ткани при Р.А. Среди ферментов системы протеолиза наибольшее значение принадлежит семейству матриксных металлопротеиназ (ММР), которые, имея определенные особенности доменных структур и функций, действуют на коллаген и протеогликановый матрикс, разрушая основное внеклеточное вещество соединительной ткани [3]. В процесс формирования эрозий вовлечено несколько подсемейств ММР, которые играют основную роль в разрушении внеклеточного матрикса, хряща и субхондральной кости [4]. Одной из основных протеиназ, участвующих в реализации деструктивных процессов при РА, отводится ММР3 [5, 6]. В ряде исследований показано наличие прямой корреляции активности ММР3 в синовиальной жидкости и сыворотке крови больных РА с темпами эрозивного процесса [7]. Кроме того, отмечалась высокая активность протеиназ ММР2 и ММР9 в тканях синовии, синовиальной жидкости и сыворотке крови у больных РА по сравнению с контрольной группой [8]. Экспериментальные исследования синовиальной ткани с использованием полимеразной цепной реакции указывают на увеличение активности ММР9 в фибробластоподобных клетках стенок сосудов. Достаточно высокая активность подсемейства желатиназ установлена в ткани на участке деструкции между паннусом и хрящом, а также костной тканью. При этом отмечается увеличение активности ММР2 в зоне паннуса, хотя доказательства ее прямого участия в формировании эрозий считаются недостаточными [9]. Исследования у больных РА позволили выявить корреляцию между такими факторами, как рентгенологические изменения в суставах, клинические данные, гистологическая оценка синовиальной ткани, и высокой активностью ММР2 и ММР9. При этом в образце синовиальной ткани в различных ее участках может отмечаться разная желатинолитическая активность, что установлено методом зимографии [10]. Показано, что уровень ММР2 коррелирует с ранними эрозиями, а уровень ММР9 — с более поздними [11]. Однако у разных пациентов уровень продукции деструкционных маркеров заметно различается. Показано, что регуляция экспрессии ММР происходит прежде всего на транскрипционном уровне, в промоторном регионе генов [12].

Исходя из этого целью работы явилось исследование полиморфизма промоторных регионов генов ММР2, ММР3 и ММР9 для оценки их ассоциативных связей с риском развития и вариантами клинического течения РА у женщин.

Пациенты. Поскольку среди представителей европеоидной расы, включая русских, РА распространен преимущественно среди женщин [13], группу пациентов в нашем исследовании составили только женщины. В исследование включены 162 пациентки, больные Р.А. Диагноз Р.А. соответствовал критериям Американской коллегии ревматологов (АКР) [14]. Клинико-лабораторное описание группы пациентов с РА представлено в табл. 1. Все пациентки давали добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

Контрольная группа. В популяционную группу контроля включены 329 женщин без хронических заболеваний, сопоставимых по возрасту с выборкой больных РА, жители Новосибирска. Средний возраст женщин составил 52,4 года (30—84 лет).

Генотипирование. Исследовали однонуклеотидный полиморфизм (промоторного региона генов ММР2-1306 С→Т, ММР3-1171 5А→6А, ММР9-1562 С→Т. Генотипирование осуществляли методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов. Участки промоторных регионов генов амплифицировали с использованием пары специфичных праймеров [15, 16], затем продукты амплификации подвергали гидролизу соответствующими эндонуклеазами рестрикции («СибЭнзим», Новосибирск). Электрофорез проводили в 2% агарозном геле.

Статистическая обработка данных. При статистическом анализе результатов исследований использовали такие показатели, как распространенность генотипов, отношение шансов (OШ) с расчетом 95% доверительного интервала (ДИ). Расчет О.Ш. проводили по методу Вульфа—Холдейна [17]. Распространенность отдельных генотипов определяли как процентное отношение индивидов, несущих генотип, к общему числу обследованных в группе по формуле: f=n/N, где n — число повторений генотипа, N — число обследованных. Распределение генотипов по исследованным полиморфным локусам проверяли на соответствие равновесию Харди—Вайнберга [18]. Достоверность различий частот распределения изучаемых признаков в альтернативных группах определяли по критерию χ² с поправкой Йетса на непрерывность и двустороннему варианту точного метода Фишера для четырехпольных таблиц [19].

Частоты всех исследованных нами генотипов металлопотеиназ С (–1306) Т гена ММР2, 5А (–1171)6А гена ММР3 и С (–1562) Т гена ММР9 в группе пациенток и здоровых находятся в равновесии Харди—Вайнберга (р=0,0512, р=0,5150, р=0,6153 для пациенток и р=0,2676, р=0,0752, р=0,0819 для группы популяционного контроля).

Анализ ассоциированности полиморфизма промоторных регионов генов ММР 2, MMP3 и ММР 9 выявил, что в группе пациенток с РА достоверно чаще встречается генотип ММР2−1306ТТ (ОШ 2,78; р=0,0026) и реже встречается гомозиготный генотип MMP3 6А6А, ответственный за более низкий уровень белкового продукта (ОШ 0,59; р=0,0376) (табл. 2).

При делении пациенток на подгруппы по наличию в сыворотке крови РФ, уровень которого превышает референсные значения, различия сохраняются только для группы больных серопозитивным РА относительно здоровых (табл. 3): тенденция снижения частоты генотипа MMP3 6А6А в группе больных серопозитивным РА относительно здоровых (ОШ 0,59; р=0,0584) и повышение частоты генотипа ММР2−1306ТТ в группе пациентов с серопозитивным РА относительно здоровых (ОШ 3,05; р=0,0017). Между группами пациенток с серопозитивным и серонегативным РА достоверных различий по частоте генотипов анализируемых генов не выявлено. При выделении подгрупп пациенток с наличием РУ и без таковых сохраняются достоверные различия, показанные для общей группы больных РА относительно здоровых женщин, — снижение у пациенток гомозиготного генотипа MMP3 6А6А (ОШ 0,29; р=0,0062 — у пациенток с наличием РУ и ОШ 0,52; р=0,0295 — у пациенток без таковых) и повышение частоты гомозиготного варианта гена ММР2−1306 ТТ в обеих группах относительно здоровых (ОШ 2,94; р=0,0498 у пациенток с наличием РУ и ОШ 3,08; р=0,0030 — у пациенток без таковых) (табл. 4).

Основной ММР, ответственной за деградацию хрящевой ткани, считается ММР3. Предполагается, что промоторный полиморфизм гена MMР3 может быть прогностическим маркером предрасположенности к патологии и отражать тяжесть ее течения [20]. Полиморфизм MMP3 5A/6A ряд авторов связывают с тяжестью течения РА, а наличие у пациентов генотипа ММР3 5А5А — с более высокой частотой ВП, чем у гомозиготных по ММР3 6А6А пациентов [21]. Эти данные находят подтверждение и в результатах наших исследований, свидетельствующих о том, что генотип MMP3 6A6A негативно ассоциируется с развитием РА и является фактором относительной устойчивости человека к развитию этого заболевания. Исследования показали, что аллельный вариант 6A связан двукратным понижением транскрипционной деятельности ММР3. Это приводит к низкому уровню продукции и его концентрации в соединительной ткани пациента, что частично может объяснять меньшую степень деструкции суставов при развитии заболевания [22]. Однако в метаанализе, проведенном Z. Feng и соавт. [23] не выявлено ассоциативных связей с развитием Р.А. Авторы считают это вероятным следствием нескольких причин: во-первых, РА — сложное заболевание, в развитии которого помимо различных внешних факторов принимают участие множество генов. Во-вторых, полиморфизм MMP3 5A/6A находится в неравновесном сцеплении с полиморфизмом MMP1 1G/2G, который связан с РА. В-третьих, возможно влияние пока не выясненных генетических факторов на развитие болезни. Поэтому авторы считают целесообразным дальнейшие исследования полиморфизма MMP3 5A/6A при РА [23]. Необходимо отметить, что в настоящее время отсутствуют единые подходы к констатации наличия ВП и их дефинициям [24]. В нашем исследовании проанализирована группа больных, имеющая такое ВП РА, как подкожные РУ, верифицированные клинически, поскольку патогенетическая связь данного ВП с «системной ревматоидной болезнью» не вызывает сомнения. При делении пациентов на подгруппы с наличием РУ и без таковых, сохранялись особенности распределения генотипов ММР3, характерные для общей группы больных относительно здоровых.

Относительно ММР2 в ряде исследований показано, что пациенты с РА и здоровые не различаются по распределению частот генотипов полиморфных позиций –1575A/G, –1306C/T и –735 C/T [25, 26]. Только по данным испанских исследователей у пациентов увеличена частота аллельного варианта гена MMP2−1306 T со сниженным уровнем белковой продукции [27], что совпадает и с нашими данными. Именно частота генотипа ММP2−1306ТТ повышена в общей группе пациентов с РА и у серопозитивных пациентов. Вероятный функциональный эффект полиморфизма MMP2 не окончательно ясен и может быть связан как с возможной инактивацией хемокинов CCL7 (моноцитарный хемотаксический белок 3) и SDF1 (фактор стромальных клеток 1-го типа) за счет связывания и их расщепления, что приводит к уменьшению воспаления и обеспечивает вазоконстрикцию [28, 29], так и с регуляцией уровня продукции ММР9, секрецию которой он стимулирует [30, 31]. Соответственно при низком уровне продукции ММР2, ассоциированной с генотипом ММР2 ТТ, в меньшей степени подавляется воспаление, и снижается стимулирование синтеза ММР9.

Что касается отсутствия ассоциативной взаимосвязи с РА полиморфизма –1562 гена ММР9, то никаких различий по частоте генотипов ММР9 между пациентами с РА и здоровыми не выявлено как в ряде исследований [20], так и в группе наших пациенток. Вероятно, механизмы реализации генной регуляции этих групп ферментов при РА регулируется иными механизмами.

Результаты исследования свидетельствуют, что наличие в геноме аллельных вариантов генов ММР, ассоциированных с высоким уровнем продукции ферментов протеолиза, воздействующих на коллаген и протеогликановый матрикс и тем самым разрушающих основное внеклеточное вещество соединительной ткани, может являться одним из генетических факторов предрасположенности женщин к развитию такого яркого представителя группы системных заболеваний соединительной ткани, как РА.