Введение

4-метоксигидроксибензол (4-метоксигидроксифенол, 4-гидроксибензол, пара-метоксифенол, пара-гваякол, меквинол) (далее — 4-МОГОБ) — биологически активное соединение, которому свойственны антисептическое, антиоксидантное и мягкое местноанестезирующее действия. В дерматологии 4-МОГОБ может применяться в сочетании с третиноином как депигментирующее средство [1—5].

Это вещество входит в состав некоторых эфирных масел, является полупродуктом органического синтеза, используется как реагент в химико-аналитической практике [6, 7].

В нормальных условиях 4-МОГОБ — это бесцветные, имеющие своеобразный (напоминающий фенольный) запах кристаллы или белый кристаллический порошок, плавящийся при 53 °C [8] или при 54 °C [7]. 4-МОГОБ ограниченно (4 г/100 мл) растворим в воде [9], растворим в бензоле, тетрахлорметане, хорошо — в этаноле и этоксиэтане, легко — в ацетоне и этилацетате [1, 7].

Как и близкие по структуре метоксипроизводные фенола (2-метоксигидроксибензол, 2-метокси-4-(2-пропенил)гидроксибензол и ряд других), 4-МОГОБ весьма токсичен по отношению к теплокровным. LD₅₀ этого соединения для крыс определен на уровне 1600 мг/кг (поступление per os), для кроликов — более 2000 мг/кг (поступление через кожу) [10].

В научной литературе имеются данные об отравлениях метоксифенолами, одним из которых является 4-МОГОБ, в том числе с летальным исходом [11—13].

4-МОГОБ может быть примесью в 1-(4-метоксифенил)пропан-2-амине, незаконно распространяемом вместо наркотического средства «Экстази» [1].

Как можно заключить, 4-МОГОБ достаточно активно используется и имеет выраженную токсичность, что позволяет отнести его к потенциальным объектам химико-токсикологического исследования. Вместе с тем 4-МОГОБ в химико-токсикологическом отношении остается малоизученным.

Цель исследования — изучение особенностей химико-токсикологического определения 4-МОГОБ.

Материал и методы

Объектами исследования являлись: субстанция 4-МОГОБ (Sigma-Aldrich, США; доля основного вещества 99% и более); модельные смеси 4-МОГОБ с тканью печени и кровью (содержание аналита 0,005—0,2%).

При выполнении исследования применяли следующие методы: тонкослойную хроматографию (ТСХ), полупрепаративную колоночную хроматографию, электронную (диапазон 190—360 нм) спектрофотометрию, высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) и газовую хроматографию с масс-спектрометрией (ГХ-МС) (фрагментация электронным ударом).

Исследовали хроматографическое поведение 4-МОГОБ и близких по структуре веществ методом ТСХ в нормальнофазовом варианте, используя пластины UV-254 (Merck, ФРГ) и стеклянные хроматографические камеры вместимостью 0,6 дм³. Пятна аналитов проявляли на хроматограммах с помощью настольного ультрафиолетового (УФ) анализатора ZF-1 (КНР), генерируя излучение с λ=254 нм.

Как один из вариантов очистки 4-МОГОБ от соэкстрактивных веществ биоматериала была рассмотрена жидкость-жидкостная экстракция. Суть очистки при этом состоит в попеременном переведении аналита в молекулярную форму, способную переходить в органическую фазу (очистка от гидрофильных примесей), и ионизированную форму, способную переходить в водную фазу (очистка от гидрофобных примесей).

Для проведения колоночной полупрепаративной хроматографии применяли колонку (150×10 см) сорбента типа «Силасорб» С-18 30 мкм. Аналит вводили в колонку в виде 0,1% раствора (2—3 мл) в элюенте. В качестве элюентов рассматривали ацетонитрил, ацетон, диоксан, а также смеси этих растворителей с водой в соотношениях 8:2, 6:4, 5:5, 4:6, 2:8 по объему. При сборе элюата его фракционировали по 2 мл.

Спектрофотометрическое определение (УФ-диапазон) осуществляли на приборе СФ-2000 («ЛОМО», Россия).

Определение методом ВЭЖХ проводили в обращеннофазовом варианте на приборе LC-20 Prominance (Shimadzu, Япония), снабженном детектором на диодной матрице, используя сильнополярный элюент «ацетатный буфер с pH 5,5—ацетонитрил» (5:5). Для проведения исследования методом ГХ-МС использовали прибор Network 6850 с МС-детектором Network 5973 (Agilent Technologies, США), снабженный колонкой с полимерной стационарной фазой на основе метилполисилоксана с фенильными заместителями (5%). Способом разрушения молекул являлся электронный удар (энергия 70 эВ). Газ-носитель гелий пропускали со скоростью 36 см³/ч.

При проведении исследований по выявлению 4-МОГОБ в биоматериале в качестве модели биоматрицы рассматривали измельченную (0,2—0,5 см) печеночную паренхиму. Модельные смеси 4-МОГОБ с биоматрицей перед началом опытов выдерживали 45 мин при температуре 20—22 °C [14].

На примере смесей аналита с печенью (концентрация аналита 1 мг/г) в режиме сравнительного изолирования проводили поиск наиболее приемлемого для выделения 4-МОГОБ из матрицы изолирующего агента.

Аналит выделяли, настаивая 2 раза (по 0,75 ч) с жидким агентом, масса которого на каждом этапе настаивания в 2 раза превышала массу смеси. Часть объединенного извлечения использовали для хроматографирования методом ТСХ (пластины «Merck» с УФ-индикатором; элюент «гексан—диоксан—пропанол-2» (40:5:1); детектирование в УФ-свете). Аналит идентифицировали по значению коэффициента скорости движения вещества в хроматографии Rf (retention factor) 0,33±0,02, после чего извлекали из тонкого слоя 95% этанолом, спектрофотометрировали элюат и оценивали содержание аналита по поглощению при 291 нм, используя уравнение регрессии:

A = 0,025396 ∙ C + 0,001199,

где: C — концентрация аналита (мкг/мл) в детектируемом элюате; A — интенсивность светопоглощения.

В дальнейшем изучали зависимость степени извлечения 4-МОГОБ оптимальным изолирующим агентом от ряда факторов.

Валидацию методики определения 4-МОГОБ в биоматериале проводили по принципам, принятым в судебно-химических и биоаналитических исследованиях [15, 16].

Результаты и обсуждение

Данные, полученные при изучении хроматографического (ТСХ) поведения 4-МОГОБ и близких структур, отражены в табл. 1. Из этой таблицы можно заключить о наибольшей приемлемости элюентов «гексан—диоксан—пропанол-2» (40:5:1) и «гексан—диэтиловый эфир» (6:4).

Таблица 1. Результаты хроматографирования 4-метоксигидроксибензола и его изомеров в тонком слое силикагеля на пластинах Merck

В табл. 2 представлены рассчитанные по результатам экспериментов значения основных критериев полупрепаративного элюирования 4-МОГОБ в колонке «Силасорб» С-18 30 мкм. Данные таблицы показывают, что в качестве оптимальных элюентов можно рассматривать смеси «диоксан—вода» (4:6) и «ацетонитрил—вода» (4:6). Последняя в дальнейшем была использована при очистке 4-МОГОБ.

Таблица 2. Параметры хроматографирования 4-метоксигидроксибензола методом полупрепаративной обращеннофазовой хроматографии обычного давления

Исследование особенностей экстракции выявило, что переведение аналита в нейтральную форму целесообразно проводить при pH 2—4, в качестве оптимального экстрагента был предложен этилацетат. Переведение 4-МОГОБ в ионизированную форму целесообразно при pH 11,5—12,0. Данное значение pH является оптимальным для перехода ионизированной формы из органической фазы в водную.

Экстинкция 4-МОГОБ (среда — 95% этанол) в диапазоне 190—360 нм характеризовалась наличием 3 полос поглощения с максимумами при 207, 225 и 291 нм. Значения молярного коэффициента поглощения (л∙моль^-1∙см⁻¹) в этих максимумах соответственно равны 5402, 6172 и 2488. В качестве аналитического использовали максимум наиболее длинноволновой полосы поглощения (291 нм), в области которого отмечалось наименьшее влияние фонового поглощение на величину оптической плотности.

При проведении анализа методом ГХ-МС применяли стационарную фазу «5% фенил—95% метилполисилоксан», нанесенную в виде слоя (0,33 мкм) на внутреннюю поверхность колонки DB-5ms EVIDEX размером 25 м × 0,2 мм, начальная температура которой составляла 70 °C, выдержка — 3 мин. Далее температуру увеличивали до 290 °C (скорость 20 °C в минуту).

Дозатор имел температуру 250 °C, интерфейс детектора — 300 °C, квадруполь — 150 °C. Обнаружение проводили в режиме записи (диапазон 40—200 m/z) по полному ионному току. Ток детектора составлял 1500 А.

Хроматограмма и масс-спектр 4-МОГОБ (стандарта) изображены на рис. 1. Как видно из рисунка, время удерживания 4-МОГОБ составило 8,495±0,008 мин, а масс-спектр данного соединения включал сигналы следующих заряженных частиц (m/z): 38, 53, 65, 81, 109, 124.

Рис. 1. Газо-жидкостная хроматограмма (а) и масс-спектр (б) стандарта 4-метоксигидроксибензола.

Для определения 4-МОГОБ методом ВЭЖХ был предложен сорбент с привитыми алкильными радикалами (C18) (колонка Discovery C18 размером 250×4,6 мм в комплексе с предколонкой 20×4,0 мм). Элюирование осуществляли смесью «ацетатный буфер с pH 5,5—ацетонитрил» (5:5) со скоростью 1000 мкл/мин. Время удерживания 4-МОГОБ при этом составляло 4,03±0,01 мин.

Была выявлена зона линейной зависимости площади хроматографического пика от уровня присутствия 4-МОГОБ в элюируемой пробе (0,008—4,0 мкг). Эта зона описывается уравнением регрессии следующего вида:

S = 848 586 ∙ C + 3130,

где: S — площадь пика (усл.ед.); C — масса аналита (мкг) во вводимой пробе.

Данные по извлечению 4-МОГОБ из композиций с печенью группой из 16 изолирующих жидкостей отражены на рис. 2. Данный рисунок демонстрирует преимущества смеси «этилацетат—ацетон» (7:3) как изолирующего агента для выделения 4-МОГОБ из биоматериала. Дальнейшие исследования показали, что наилучшими условиями выделения аналита этой смесью является двукратное (по 0,5 ч) настаивание при минимальном отношении масс извлекающего агента и биоматрицы 2:1.

Рис. 2. Результаты извлечения 4-метоксигидроксибензола из модельных композиций с тканью печени группой жидких изолирующих агентов.

Схема химико-токсикологического исследования 4-МОГОБ

Стадия изолирования. Около 25 г модельной композиции ткани печени или крови с 1,25—50,0 мг аналита настаивали с порциями (50 мл каждая) смеси «этилацетат—ацетон» (7:3) двукратно по 30 мин, перемешивая каждые 8—10 мин. Полученные вытяжки объединяли и испаряли, используя поток воздуха, при температуре 22—24 °C.

Стадия очистки. Оставшийся по окончании стадии изолирования сухой субстрат растворяли в 5 мл эфира, раствор разбавляли 5 мл гексана и экстрагировали (10 мл×2) буферным раствором с pH 11,5—12,0. pH водно-щелочного экстракта доводили до 2—4, прибавляя 24% раствор HCl, и проводиди экстракцию (20 мл×2) этилацетатом. Полученное этилацетатное извлечение испаряли в токе воздуха при температуре 22—24 °C. Оставшийся после испарения сухой субстрат обрабатывали 2 мл ацетонитрила, прибавляли 1 мл воды, полученный раствор помещали в колонку (150×10 см) сорбента типа «Силасорб» С-18 30 мкм и проводили элюирование смесью растворителей «ацетонитрил—вода» (4:6). При сборе элюата его фракционировали по 2 мл. Группу фракций с 10 по 13, внесенную в выпарительную чашку, упаривали до небольшого (0,5—1,0 мл) объема в потоке воздуха с температурой 18—24 °C, затем полностью удаляли растворители в токе азота. В чашку с оставшимся сухим субстратом последовательно приливали порции этилацетата по 2,0—2,5 мл каждая, растворяя субстрат и количественно перенося растворы в мерную колбу на 10 мл. Содержимое колбы доводили до метки этилацетатом, получая раствор для исследования. По 3 мл этого раствора помещали в чашки для выпаривания (А, Б и В) и затем удаляли растворитель из чашек.

Исследование методом ТСХ. Остаток в чашке А 3—4 раза обрабатывали порциями этилацетата по 0,2—0,3 мл каждая и последовательно наносили растворы в одну и ту же зону размером 40×10 мм линии страта хроматографической пластины «Merck». При хроматографировании применяли подвижную фазу «гексан—диэтиловый эфир» (6:4). Пятна аналита проявляли на хроматограммах под действием УФ-излучения (λ=254 нм). Рассчитывали значение Rf и по его совпадению с Rf 4-МОГОБ-стандарта (0,44±0,02) осуществляли идентификацию аналита.

Исследование методом УФ-спектрофотометрии. После проведения исследования методом ТСХ аналит извлекали из сорбента, элюируя 15 мин этанола (5 мл), и фотометрировали элюат в диапазоне 190—360 нм. Анализируемое вещество идентифицировали исходя из формы спектральной линии и локализации максимумов поглощения (длины волн 207, 225 и 291 нм).

Исследование методом ГХ-МС. Проводили растворение остатка в чашке Б в 3—4 мл дихлорметана, доводя до объема 5 мл в мерной колбе. Далее 4 мкл содержимого колбы вносили в испаритель при делении потока 1:2. Порядок определения соответствовал описанному выше. Внешний вид хроматограммы аналита, извлеченного из модельной матрицы (ткань печени), и его масс-спектр изображены на рис. 3. Критерии идентификации — время удерживания аналита в колонке, совпадающее с таковым у стандарта, и специфический набор сигналов характеристических ионов в его масс-спектре.

Рис. 3. Газо-жидкостная хроматограмма (а) и масс-спектр (б) 4-метоксигидроксибензола, извлеченного из биоматериала (ткани печени) и прошедшего очистку.

Исследование методом ВЭЖХ. Проводили растворение остатка в чашке B в 5 мл ацетонитрила, затем количественно переносили полученный раствор в мерную колбу емкостью 10 мл, а ее содержимое доводили буферным раствором с pH 5,5 (ацетатный буфер) до метки. Далее 20 мкл, взятые из раствора в колбе, вводили в хроматограф и в описанных выше условиях проводили определение, используя подвижную фазу «буферный раствор с pH 5,5—ацетонитрил» (5:5). Критерием идентификации аналита при этом являлось время удерживания, составляющее для стандарта 4-МОГОБ 4,03±0,01 мин.

Площадь пика служила основой количественного определения аналита, осуществляемого по уравнению регрессии (градуировочного графика), приведенному выше. Количественное содержание аналита рассчитывали в единицах массы и процентах, учитывая его навеску, изначально добавленную в биоматрицу (ткань печени или кровь). Результаты представлены в табл. 3.

Таблица 3. Результаты количественного определения 4-метоксигидроксибензола в модельных смесях с биологическими объектами

Данные таблицы позволяют заключить, что разработанные методики позволяют обеспечить достаточно высокий выход 4-МОГОБ из модельных композиций с печеночной тканью (86,12—87,06%) и кровью (87,70—88,44%), если содержание аналита в биоматериале колеблется в диапазоне 0,005—0,2%.

Установленные пределы обнаружения 4-МОГОБ в ткани органа (печени) и крови равны соответственно 0,08 и 0,06 мг, пределы количественного определения — 0,14 и 0,10 мг в 100 г биоматрицы. Валидационные действия в отношении предложенных методик показали их соответствие установленным критериям линейности, прецизионности, правильности и селективности.

Выводы

1. Экспериментально обоснованы преимущества извлечения 4-метоксигидроксибензола из биоматериала в режиме двукратного получасового настаивания с изолирующей смесью «этилацетат—ацетон» (7:3) при условии, что масса смеси превосходит массу биоматрицы в 2 раза.

2. Предлагаемая схема очистки аналита, выделенного из биомариц, включает жидкость-жидкостную экстракцию и хроматографию в колонке сорбента «Силасорб» С-18 30 мкм. Идентификация и оценка количественного содержания проводится методами ТСХ, спектрофотометрии, ГХ-МС и ВЭЖХ.

3. Выполнена разработка методик определения 4-МОГОБ в биоматрицах. Методики обеспечивают выход аналита из печеночной ткани и крови в количествах 86,12—87,06 и 87,70—88,44% соответственно, если концентрация вещества в биоматрице колеблется в диапазоне 1,25—50 мг на 25 г.

4. Предложенные на основе проведенных исследований методики соответствуют валидационным критериям линейности, прецизионности, правильности и селективности.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.