Введение

Общепризнанным примером хронической боли в практической медицине является фибромиалгия (ФМ). Распространенность фибромиалгии в общей популяции варьирует от 0,2% до 6%. [1]. Фибромиалгия чаще всего манифестирует вследствие стрессорных воздействий и представляет собой хроническую распространенную боль, ассоциированную с повышенной утомляемостью, нарушением сна, тревожно-депрессивными и когнитивными расстройствами [2]. Патогенез ФМ сложен и не до конца изучен. В реальной клинической практике заболевание плохо диагностируется и трудно поддается терапии, так как причины развития ФМ неясны, несмотря на широкий набор предполагаемых механизмов патогенеза боли и ассоциированных симптомов [3, 4]. В настоящее время считается, что физические и психологические стрессовые события, неадаптивные стратегии преодоления являются предрасполагающими факторами ФМ, вследствие чего возникают нарушения в системах регуляции боли, которые приводят к развитию гипералгезии (повышенной реакции на повреждающие стимулы) и аллодинии (болевых реакций на легкие тактильные и температурные стимулы). Нарушения в центральной обработке боли при ФМ также связывают с нейровоспалением, особой нейропластичностью, обусловленной генетическими полиморфизмами, дисфункцией гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси, психологическими проблемами [5].

В начале 2000-х годов для лучшего понимания нейробиологии ФМ был предложен ряд экспериментальных моделей, связанных с ваготомией животных, основанных на системном истощении биогенных аминов резерпином или вызванных прерывистым холодовым стрессом [6, 7]. Ранее нами было показано, что природа, продолжительность и интенсивность стрессорного воздействия во многом может влиять на характер изменения болевой чувствительности и определять его [8, 9]. Характер стрессорного воздействия оказывает разнонаправленное влияние на боль. В одних случаях воздействие острого стресса приводило к снижению болевой чувствительности у животных — к стресс-анальгезии, в других случаях при повторных или хронических стрессорных нагрузках возникала стресс-индуцированная гипералгезия. Направленность изменения болевой чувствительности при стрессе отражает адаптивный или дезадаптивный характер приспособительных реакций. В настоящей работе отрабатывали параметры интермиттирующего стрессорного воздействия на крыс, ведущего к развитию генерализованной гипералгезии и аллодинии.

Материал и методы

Эксперименты выполнены на крысах-самцах линии Wistar (n=28) с массой 230—270 г. Все процедуры и эксперименты на животных проводили в соответствии с Межгосударственными стандартами ГОСТ 33215-2014, ГОСТ 33216-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными», соответствующими Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых в экспериментах и в других научных целях (ETS N 123, Страсбург, 18 марта 1986 г. с приложением от 15.06.2006). Исследования проводили под контролем этического комитета ФГБНУ «НИИОПП».

Животные были разделены на три группы: 1-я группа (n=8) — интактный контроль; 2-я группа (n=10) — животные, подвергнутые воздействию изоляции; 3-я группа (n=10) — животные, подвергнутые сочетанному воздействию изоляционного и повторяющегося холодового стресса (ИПХС). Все три группы животных имели свободный доступ к воде и пище. Животные 1-й (контрольной) группы содержались в одной клетке размерами 55,0×19,0×32,0 см при комнатной температуре (22±2°C), а животные 2-й и 3-й группы были размещены по одному в клетки размерами 21,0×14,5×14,0 см. В этих условиях животные содержались в течение всего эксперимента.

Для изучения сочетанного воздействия ИПХС (3-я группа животных) в 9:00 крыс помещали в холодильник Polair объемом 1,4 м³ при температуре 4±2°С на 40 мин, а затем попеременно подвергали воздействию комнатной температуры (22±2°C) в течение 30 мин и холода (t=4±2°С) в течение 40 мин до 20:00. Далее животных доставали из холодильника и оставляли до 9:00 при комнатной температуре. Эти процедуры повторяли в течение 5 дней.

Оценку изменения порогов болевой реакции (ПБР) у животных проводили с помощью электронного алгезиметра Рэндалла—Селитто (IITC, США), а для измерения порога тактильной чувствительности (ПТЧ) использовали эстезиометр фон Фрея с набором филаментов Supertips^TM (IITC, США) диаметром 0,8 мм с силой воздействия от 0,4 до 74 г. Измерения проводили за сутки до начала эксперимента, а также в 1-й, на 7-й, 14-й и 21-й день после его окончания. Принимая во внимание тот факт, что болевые пороги у грызунов подвержены циркадным колебаниям, измерение ПБР и ПТЧ проводили в одно и то же время. Следует отметить, что перед началом экспериментов в течение 3 дней крыс приучали к оборудованию, используемому для этих тестов.

Измерение ПБЧ проводили на правой и левой лапе трижды с интервалом в 1—2 мин (диаметр кончика зонда 1 мм). Для каждого животного рассчитывали среднее значение всех трех измерений. С этой целью животных аккуратно фиксировали при помощи слип-костюма, закрепленного на штативах (IITC, США), после чего постепенно увеличивали давление зонда на мышцы стопы задней лапы. ПБР определяли как приложенную силу в граммах, вызывающую либо отдергивание лапы, либо вокализацию.

Для измерения ПТЧ животных помещали по одному в акриловые клетки размерами 21,0×13,0×10,0 см с металлическим сетчатым полом (диаметр ячейки 0,6 см). Период привыкания к условиям теста составлял 10—15 мин. Сначала определяли ПТЧ при воздействии филаментов фон Фрея на подошвенную поверхность левой задней лапы, начиная с гибкого филамента с силой воздействия 74 г, а кончик нити прикладывали перпендикулярно к середине подошвенной поверхности и равномерно надавливали до сгибания филамента в течение 6 с. При положительной реакции использовали филамент с меньшей силой воздействия. Измерения проводили трижды с интервалом в 10—15 с. В каждой группе рассчитывали среднее значение силы воздействия приложенных нитей (m±sem). Ту же процедуру повторяли на правой лапе. Во всех измерениях за положительный ответ принимали отдергивание лапы при воздействии или сразу после удаления филамента, а также различные способы уклонения от воздействия. Положительным ответ считался, если животное реагировало не менее 2 раз.

Статистическую обработку данных осуществляли по алгоритмам программы GrafPad 8. Проводили предварительную проверку предположения о нормальном характере распределения в каждой экспериментальной группе по тестам Колмогорова—Смирнова. При нормальном распределении оценку значимости показателей и различий для связанных выборок проводили с помощью одностороннего дисперсионного анализа (One-way ANOVA) с использованием post-hoс-критерия Tukey с поправкой Гейссера—Гринхауса. Оценку значимости показателей и различий между независимыми выборками проводили с помощью одностороннего дисперсионного анализа (One-way ANOVA). Данные представлены как среднее значение (M) ± стандартное отклонение (SD) или стандартная ошибка среднего (SEM). Статистически значимыми результаты считали при уровне p<0,05. При распределении, отличном от нормального, оценку значимости показателей и различий рассматриваемых выборок проводили по Т-критерию (парному критерию Уилкоксона) для связанных выборок и по U-критерию Манна—Уитни для оценки различий между двумя независимыми выборками. В качестве средней выборочной характеристики использовали медиану (Me), первый и третий квартили (Q₁; Q₃). Оценку качественных эффектов проводили по точному методу Фишера. Во всех случаях различия считали статистически значимыми при уровне p≤0,05.

Результаты

Оценка ПБР по тесту Рэндалла—Селитто и ПТЧ по тесту фон Фрея показала, что исходные показатели у животных всех групп не различались, также не было выявлено различий между показателями правой и левой лап на протяжении всего эксперимента (рис. 1, 2). Следует отметить, что у контрольных животных ПБР и ПТЧ не менялись на протяжении всего эксперимента (см. рис. 1, 2).

Рис. 1. Влияние сочетанного воздействия изоляции и ПХС на пороги болевой чувствительности в тесте Рэндалла—Селитто.

а — левая лапа; б — правая лапа. ПХС — повторяющийся холодовый стресс. **** — p=0,0006, *** — p=0,002, ** — p=0,01, * — p=0,048 по сравнению с соответствующими показателями группы контроля; ⁺⁺⁺ — p=0,000, ⁺⁺ — p=0,003, ⁺ — p=0,01 по сравнению с соответствующими показателями до эксперимента; ^# — p=0,01 по сравнению с соответствующим показателем группы изоляции.

Рис. 2. Число животных с положительным ответом по тесту фон Фрея после воздействия изоляции и сочетанного воздействия изоляции и повторяющегося холодового стресса, %.

а — левая лапа; б — правая лапа. ПХС — повторяющийся холодовый стресс. ⁺⁺ — p=0,025, ⁺ — p=0,05 по сравнению с соответствующими показателями до начала эксперимента.

Оценка изменений ПБР у животных 2-й группы (подвергнутых только изоляции) выявило снижение ПБР на 7-й день после окончания эксперимента по сравнению с ПБР до начала эксперимента. Это снижение обнаружено как на правой лапе (на 34,07%), так и на левой лапе (на 26,56%) (p=0,001 и p=0,04 соответственно) (см. рис. 1). В последующие дни наблюдения значения данного показателя в этой группе не отличались от значений, полученных до начала эксперимента, и от значений данного показателя в контрольной группе. У животных 3-й группы (подвергнутых сочетанному воздействию ИПХС) ПБР левой и правой лапы после воздействия были ниже по сравнению с ПБР до воздействия и с ПБР в контрольной группе в течение всего периода наблюдения (см. рис. 1).

Оценка изменений ПТЧ до начала эксперимента с использованием гибких филаментов Supertips^TM по тесту фон Фрея показала, что большинство животных во всех группах не реагировали на воздействие филаментов диаметром 0,8 мм с силой воздействия от 0,4 до 74 г (см. рис. 2), это свидетельствует о том, что в данных условиях эксперимента ПТЧ превышали силу воздействия в 74 г. Измерения, проведенные в 1-й, на 7-й, 14-й и 21-й день после окончания эксперимента, показали, что в группе интактного контроля ПТЧ и количество животных с положительным ответом на филаменты не отличались от таковых до начала эксперимента (табл. 1, 2, см. рис. 2). В группах изоляции (2-я группа) и сочетанного воздействия ИПХС (3-я группа) в течение всего периода наблюдения фиксировали увеличение числа животных с положительным ответом на филаменты, а также снижение ПТЧ по сравнению с этими показателями до начала эксперимента и с этими показателями в группе контроля. Причем данные изменения были более выраженными в группе сочетанного воздействия ИПХС (см. табл. 1, 2, см. рис. 2).

Таблица 1. Изменение порогов тактильной чувствительности левой лапы крыс-самцов линии Wistar по тесту фон Фрея после воздействия изоляции и сочетанного воздействия ИПХС

Примечание. Данные представлены в виде медианы, первого и третьего квартилей: Me (Q₁; Q₃). ИПХС — изоляционный и повторяющийся холодовый стресс. **** — p=0,002, *** — p=0,004, ** — p=0,02, * — p=0,04 по сравнению с соответствующими показателями до начала эксперимента; ^#### — p=0,000, ^### — p=0,002, ^## — p=0,02, ^# —p=0,049 по сравнению с соответствующими показателями группы контроля; ^{^^} — p=0,01, ^{^} — p=0,03 по сравнению с соответствующими показателями группы ИПХС.

Таблица 2. Изменение порогов тактильной чувствительности правой лапы крыс-самцов линии Wistar по тесту фон Фрея после воздействия изоляции и сочетанного воздействия ИПХС

Примечание. Данные представлены в виде медианы, первого и третьего квартилей: Me (Q₁; Q₃). ИПХС — изоляционный и повторяющийся холодовой стресс. **** — p=0,002, *** — p=0,004, ** — p=0,02, * — p=0,03 по сравнению с соответствующими показателями до начала эксперимента; ^#### — p=0,001, ^### — p=0,002, ^## — p=0,01, ^# — p=0,02 по сравнению с соответствующими показателями группы контроля.

Наблюдение за динамикой изменения болевой и тактильной чувствительности по тестам Рэндалла—Селитто и фон Фрея показало, что воздействие изоляции в течение 5 дней не оказывало существенного влияния на ПБР, но вызывало увеличение числа животных с положительным ответом на филаменты диаметром 0,8 мм с силой воздействия от 0,4 до 74 г, а также снижение ПТЧ. Сочетанное воздействие ИПХС в течение 5 дней существенно снижало как ПБР, так и ПТЧ. Если снижение ПБР в тесте Рэндалла—Селитто свидетельствует о развитии механической гипералгезии, то в случае теста фон Фрея снижение ПТЧ может рассматриваться как проявление аллодинии. Эти изменения сохранялись в течение длительного времени (21 день). Таким образом, результаты проведенного исследования свидетельствуют об обоснованности использования модели интермиттирующего стрессорного воздействия в качестве экспериментальной модели генерализованной боли.

Обсуждение

Как известно, повторяющийся холодовый стресс (ПХС) является экспериментальным стрессовым состоянием, которое, как показано рядом авторов, вызывает стойкую гипералгезию. Поскольку было обнаружено, что модель ПХС имеет схожие патофизиологические и фармакотерапевтические характеристики с клиническими данными, авторы предположили, что эти модели животных могут быть полезны при разработке новых лекарств от ФМ [10]. При этой форме стресса мышей и крыс переводят каждые 30 мин или 1 ч из комнаты с температурой 22—24°C в холодную комнату с температурой 0—4°C или от 0 до −3°C, на ночь животные остаются в холодной комнате [7, 10]. Условия ПХС похожи на условия работы людей в холодильных камерах. Такие люди часто жалуются на хронические скелетно-мышечные боли [11, 12]. В ранее проведенных исследованиях показано, что ПХС при температуре 1—4°С вызывал двухстороннюю гипералгезию (снижение ПБР в тесте Рэндалла—Селитто), но не вызывал кожную аллодинию (снижение ПТЧ в тесте фон Фрея) [10]. В то же время известно, что пациенты с ФМ испытывают боль от прикосновения [10]. В данном исследовании мы обнаружили, что, сочетая два вида стресса — изоляцию и повторный холодовый стресс (ИПХС), можно добиться развития у животных длительной (более 3 нед) двусторонней гипералгезии и аллодинии.

Заключение

Результаты проведенного исследования, представленного в настоящей статье, свидетельствуют об обоснованности использования модели интермиттирующего стрессорного воздействия в качестве экспериментальной модели генерализованной боли.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.