Введение

Установление времени, прошедшего с момента смерти, имеет решающее значение при расследовании преступлений, однако существующие методы подвержены целому ряду ошибок. Например, комплексные судебно-медицинские и энтомологические экспертизы используются для оценки продолжительности постмортального интервала, но погрешность определения давности наступления смерти данным способом может варьировать в широких пределах [1]. Проведенный эксперимент с задействованием трупов модельных животных показал, что количественная и качественная динамика постмортального микробиома является измеряемой и повторяемой (воспроизводимой), а значит, может обеспечить дополнительный (к традиционным судебно-медицинским) инструмент оценки продолжительности постмортального интервала.

Целью работы — описание становления судебно-микробиологической экспертизы как анализа нового типа, который можно определить следующим образом: выявление и фиксация достоверно измеримых изменений эколого-физиологического характера, происходящих в некробиоме, чтобы привести доказательства возможности ориентации на микробиологические параметры в ходе определения давности наступления смерти.

Материал и методы

Для решения поставленной цели были обобщены результаты разноплановых исследований посмертного микробиома применительно к прикладным задачам судебно-медицинской экспертизы, связанным с определением давности наступления смерти, особенно при поздних трупных изменениях. Особое внимание было уделено экологической роли микроорганизмов в составе некробиома/танатомикробиома как активных участников деструкции органического вещества, сопровождаемой последовательным изменением состава сообществ микроорганизмов. Означенные микробные сообщества ассоциируются с конкретной территорией, где располагается популяция, в зависимости от трофического статуса вида.

Результаты

Природные сообщества микроорганизмов исследуются на протяжении многих лет; это доказывает факт несомненной значимости микробиологических аспектов в очень многих научных сферах [2—8], даже в тех областях, которые не так давно не имели никакого отношения к микроорганизмам [9]. Одноклеточные имеют ряд физиологических, биохимических и генетических особенностей, информация о них сегодня широко применяется в рамках анализа циркадного ритма [10], она имеет высокую важность в нейрофизиологии [11], велика ее роль и при изучении онкологических [12, 13] и метаболических заболеваний [14]. Кроме того, ряд исследований рассматривает возможности использования тех или иных эколого-физиологических свойств некробиома в судебно-медицинской экспертизе [15—22].

Публикация работ C. Achard и E. Phulpin [23], в которых рассматривается многообразие разновидностей микроорганизмов, выявленных в постмортальных микробиомах, началась с 1985 г. Именно с того времени и начали активно обсуждать ценность некробиома для выполнения задач, поставленных перед судебной медициной. В ходе исследования структурного состава некробиома кожи были обнаружены данные, позволившие говорить о специфике видового разнообразия микрофлоры кожи. Качественные и количественные динамические характеристики некоторое время остаются стабильным. Если труп находится в помещении, где температура воздуха приближена к комнатной, эти показатели могут оставаться неизменные в течение порядка 14 сут [24].

Далее были получены абсолютно объективные доказательства того, что после смерти человека можно идентифицировать его личность на основании информации, полученной по индивидуальному профилю микробиома [25—30]. Сегодня микробиология базируется на таком методе, как пиросеквенирование [31—34]. Это позволяет в значительной мере расширить представления об использовании микроорганизмов. Соответственно, появляется возможность провести независимую оценку результатов, которые были получены посредством традиционных методов судебной экспертизы. Таким образом, сопоставление индивидуальных характеристик посмертного микробиома со сроком наступления смерти человека является максимально достоверным.

Когда меняется количество микроорганизмов, а вместе с тем происходят изменения в скорости разложения биологических тканей, можно говорить о том, сколько времени прошло с момента наступления смерти [35—40]. В ходе путрификационного процесса разновидности микроорганизмов выстраиваются в систему, обладающую сложной иерархией. Все эти разновидности принадлежат либо к природным микробным сообществам, либо к биотопам организма, имеющим место еще до наступления смерти.

Особое значение имеет тот факт, что по мере разложения трупа происходят постоянные изменения его химического состава. Летучие соединения, которые образуются при разложении белков, жиров и полисахаридов, накапливаются. Высвобождающиеся минеральные составляющие (медь, кальций, магний, железо), а также фосфаты, азот и сера задействуются в процессах конструктивного и энергетического метаболизма гнилостной микрофлоры [41, 42]. Биомасса микробного сообщества растет за счет роста скорости репликации микробных клеток в единицу времени.

Колонизация тканей некрофильной микрофлорой происходит последовательно и затрагивает все ткани без исключения [43]. На активной стадии путрификации нарушается целостность мертвого тела; обогащенные аммиаком выделяемые жидкости поступают в почву. Соответственно, растет концентрация азота в почве, изменяя кислотную среду ложа трупа. Микроорганизмы, испытывающие высокую потребность в азоте и способные приспособиться к переменам в химическом составе среды, усиленно начинают контаминировать труп и ложе трупа.

Существенную важность представляет то обстоятельство, что в естественных условиях у каждого вида микробов имеется собственная субстратная специализация, выраженная довольно отчетливо. Она ориентирована на то, чтобы контролировать разложение мертвой органики. В связи с этим микроорганизмы некробиома могут рассматриваться как потенциальный инструмент судебно-медицинской экспертизы. Они позволяют провести диагностику, определить, в какое время наступила смерть, а также установить продолжительность постмортального интервала. Важную роль микроорганизмов признают такие научные деятели, как В.Л. Наговской [44], Н.П. Движков [45], М.Г. Береза [46, 47], А.В. Вальтер [48], С.И. Попов [49], В.Г. Петровская и О.П. Марко [50]. Все эти ученые единогласно сошлись во мнении, что с точки зрения биологических процессов микроорганизмы способны доказать важные обстоятельства для юристов.

Кроме того, проведенные в рамках изучения этого вопроса эксперименты доказали, что существует возможность применять в качестве критериев уточнения продолжительности постмортального интервала ряд биохимических параметров постмортального микробиома, такие как активность каталазы [51, 52] или казеинолитическая активность [53]. В рамках экспериментов было установлено, что бактериальные сообщества, имеющие связь с телом умершего, представлены в огромном разнообразии. У них есть межиндивидуальная вариабельность, которая имеет достаточно высокую степень. Это свидетельствует о том, что ферментная активность претерпевает изменения, поэтому активность таких ферментов, как конститутивные и индуцибельные протеолитики (обладающие относительной стабильностью в каждое конкретное время в процессе путрификации), может быть использована в работе судмедэксперта.

В работе Ю.Б. Габель (2005) описан сравнительный анализ таких биологических методов исследований, как энтомологический, микробиологический, метод дендрохронологии, с точки зрения использования их в качестве новых видов экспертиз в судебной практике [54]. В исследовании приводятся доказательства использования различных биологических систем в качестве детекторов для проведения судебно-медицинского анализа. А принцип использования микробиологических параметров в судебной практике, как считает автор, связан с контролем реакции биологической системы (клеток, бактерий) на определяемый следовой компонент.

Для того чтобы идентифицировать личность человека по его следам, применяются такие методы, как ДНК-анализ и ольфакторный метод. В первом случае оцениваются клеточные структуры, во втором — следы крови и пота. В настоящее время, используя эти методы, невозможно установить срок давности наступления смерти. Вполне вероятно, что это можно связать с тем, что на сегодняшний день не существует ясной классификации и систематизации методов, задействующих биообъекты (растения, животных, птиц, насекомых, ткани человека и его биожидкости).

Стоит отметить, что сегодня предложено огромное количество вариантов биологических методов уточнения давности наступления смерти [55—62], бо́льшая часть которых имеет ряд серьезных ограничений. Именно поэтому для объективной оценки продолжительности постмортального интервала лучше всего комбинировать разные способы. В таком случае результат анализа будет наилучшим. Этим же можно объяснить тот факт, что в практике судебно-медицинской экспертизы необходимо на постоянной основе разрабатывать и проверять новые современные методы решения данного вопроса [63].

Поскольку микробиоценозы формируют тесные ассоциации с трупом на разных стадиях его разложения, можно сделать вывод о том, что микробиологический подход должен использоваться для решения вышеуказанной задачи [64—67]. При этом важно обеспечить соблюдение ряда критериев. Так, бактериальная ДНК, выделенная из биоценозов трупа, позволяет адекватно характеризовать и сравнивать специфические бактериальные сообщества трупа и бактериальные метаболиты, включая интермедиаты микробного происхождения, которые сохраняются в трупе соответственно периоду разложения; индивидуальность посмертной микрофлоры доказуема путем оценки степени сходства между бактериальными сообществами трупа человека и окружающей среды. Для этого в современных исследованиях, посвященных некробиому человека, применяются анализ филогенетического сходства [68] и высокопроизводительные методы пиросеквенирования [69, 70].

Применение микробиологической судебно-медицинской экспертизы, основанной на данных метабалома, протеома или липома посмертной микрофлоры, может на практике оказать существенную помощь в уголовных расследованиях и последующих преследованиях за биологические преступления, включая акты биотерроризма. Точность полученной информации будет зависеть от способа сбора биологического материала, скорости распада тканей трупа, набора абиотических факторов среды и других характеристик [71—73].

Высокие стандарты обеспечения качества и контроля современных методов молекулярной биологии при микробной судебной экспертизе обеспечат получение объективных данных, которые могут в дальнейшем рассматриваться в суде.

В то же время I.G. Petrisor и соавт. (2006) полагают, что технологии, на которые опираются криминалисты при проведении микробиологических исследований, необходимо тщательно проверять, методы — сертифицировать; единицы измерения и иные параметры оценок полученных результатов — стандартизировать [74].

В качестве объектов для сбора микробиологических доказательств можно использовать: жизнеспособные образцы микроорганизмов живого человека или его трупа, образцы почвы (ложа трупа), одежду или иные следовые доказательства, характерные для данного криминального процесса или явления и в конкретных условиях свершившегося преступления [75—85]. При этом биологическими агентами могут быть бактерии, вирусы или микроскопические грибы. Данные по последним группам в составе некробиома в настоящее время отсутствуют.

Были проведены исследования на тему того, как изменяется посмертная микрофлора. В рамках изучения вопроса были выполнены модельные эксперименты на трупах животных. Полученные в результате данные можно считать серьезной доказательной базой [86—88]. Они позволили в большой мере сократить переменные, которые оказывают воздействие на микробное разложение тела. То, что в ходе экспериментов были использованы трупы животных, можно объяснить этическими, правовыми и иными трудностями, которые не дали возможности использовать в процессе трупный материал человека, который имеет общее по физиологическим и медицинским параметрам с одинаковыми причинами смерти и посмертными условиями.

Эффективность использования трупов животных в рамках экспериментов, проведенных в схожих условиях, уже давно доказана [89]. В своих трудах J.R. Melvin и соавт. [90] и D.O. Carter и соавт. [91], R. Janaway и соавт. [92], P. Listos и соавт. [93], Z.M. Burcham и соавт. [94] приводят итоги изучения трупов грызунов. Эти работы содержат первичные данные по таксономическим признакам микробов, позволяющим осуществить их видовую классификацию. Означенные микробы в упомянутых работах рассматриваются в связи с определенными стадиями разложения. Ряд ограничений, взаимосвязанных с использованием бактериологических методов исследования в силу доказанного наличия в природных сообществах так называемых некультивируемых форм микроорганизмов, могут быть восстановлены посредством высокопроизводительного секвенирования. Это позволяет объективно оценить биоразнообразие некробиома и изменения его состава во времени [86, 89, 95, 96].

Некоторые задачи судебной медицины крайне сложно выполнить. Это объясняется недостаточностью информации, например, о сапротрофах. Эта разновидность микроорганизмов производит колонизацию мертвого тела, прибывая из внешней среды [97—99]. Крайне мало имеется также данных о так называемых сапротрофных оппортунистах — гетеротрофах, питанием которых служит органика. Эта разновидность микроорганизмов появляется в ходе путрификационного процесса, что обусловлено появлением в теле особых ферментов. Ряд условно-патогенных микробов, входящих в микробиом живого тела, после смерти этого тела «переформатируются» в иные разновидности микроорганизмов, при этом имея определенные и существенные преимущества перед микроорганизмами, проникающими извне.

В количественных и качественных параметрах сообществ сапротрофных оппортунистов происходят заметные изменения после наступления смерти живого организма. Однако надлежащим образом это обстоятельство пока не изучено [100]. При этом стоит признать, что изучение вышеуказанного вопроса очень ценно в рамках определения продолжительности постмортального интервала.

Заключение

Изучение закономерностей того, как взаимодействует человек при жизни и его тело после смерти с эндогенной и экзогенной флорой, закладывает основы для решения целого ряда как классических, так и вновь появляющихся прикладных задач судебной медицины, а также позволяет говорить о возможности выделения судебно-микробиологической экспертизы в отдельное направление судебно-медицинской экспертизы.

Объектами судебно-микробиологической экспертизы будут выступать внутренняя микробиота человека и его экзогенная флора, а также характер их воздействия на живые и мертвые ткани.

Предметом судебно-микробиологической экспертизы является весь диапазон динамических закономерностей взаимодействия внутренней микробиоты живого человека и некробиома его тела. Важно подчеркнуть, что внешняя среда характеризуется значительным разнообразием факторов воздействия, как биологических, так и небиологических, что тоже играет свою роль при определении этих закономерностей.

Судебно-микробиологическая экспертиза открывает перед специалистами обширные перспективы. Так, с ее помощью становится возможным установить длительность посмертного интервала, верифицировать ложе трупа, определить время получения телом повреждений, дать экспертное заключение о характере биологического повреждающего фактора и др.

В рамках разработки такого направления, как судебно-микробиологическая экспертиза, перед специалистами встает задача разработать методы, позволяющие достоверно решать экспертные задачи, которые могут быть бактериологическими, и даже молекулярно-генетическими. В этой связи не последнюю роль играет правильное определение объекта исследования — будут ли это слизистые, наружная поверхность кожи, отделы желудочно-кишечного тракта и т.д.

Помимо этого, перед специалистами стоит задача найти модель, на основании характеристик которой будет произведен сравнительный анализ. Здесь могут быть использованы трупы и биологические ткани живых существ, а также фрагменты среды обитания. Важно провести сертификацию методов и стандартизировать критерии, посредством которых возможно будет оценить полученные в ходе работы результаты.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда №23-25-10061, проводимого совместно с Республикой Карелия, и финансирования из Фонда венчурных инвестиций Республики Карелия.

The study was supported by the grant of the Russian Science Foundation No. 23-25-10061, conducted jointly with the Republic of Karelia and funded by the Venture Investment Fund of the Republic of Karelia.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.