Введение
Мебеверин является миотропным спазмолитиком, механизм действия которого основан на блокаде быстрых натриевых и медленных кальциевых каналов на мембране миоцита, что замедляет ее деполяризацию и препятствует сокращению мышечных волокон. Мебеверин быстро и полностью всасывается после приема внутрь, однако молекула подвергается пресистемному гидролизу и в плазме обнаруживаются только его основные метаболиты — мебевериновая кислота (МК) и деметилмебевериновая кислота (ДММК). По данным литературы, для метаболитов определены следующие фармакокинетические параметры: соотношение AUC0—t/AUC0—∞ для МК составляет 88,51%, для ДММК — 86,26%; максимальные в плазме крови — 62,52±35,01 и 291,81±125,92 нг/мл, соответственно; средние значения Tmax — 3,27±1,03 и 3,19±1,48 ч соответственно [1]. Лекарственная форма пролонгированного действия позволяет использовать схему дозирования 2 раза в сутки. При приеме повторных доз препарата значительной кумуляции не происходит [1—3].
Отравления препаратами мебеверин встречаются крайне редко. Однако в случаях передозировки препарата симптомы либо отсутствовали, либо были незначительными и, как правило, быстро обратимыми и носили неврологический и сердечно-сосудистый характер, в том числе проявлялись в виде сухости во рту, нарушений зрения, задержки мочеиспускания [1, 3].
Мебеверин является сложным эфиром вератровой (3,4-диметоксибензойной) кислоты и мебеверинового спирта, которые в виде указанных метаболитов выводятся преимущественно с мочой, а также частично в виде ДММК [4—6].
По данным ряда литературных источников [5—8], мебеверин вызывает ложноположительные результаты иммунохроматографического исследования на амфетамины, что может быть обусловлено обнаружением в пробах биожидкости пара-метоксиамфетамина, метоксиэтиламфетамина и гидроксиэтиламфетамина, также являющихся метаболитами мебеверина. Для получения однозначного ответа на вопрос имелось медикаментозное применение мебеверина или использование психоактивного вещества из группы амфетамина — необходимо провести исследование на специфический метаболит мебеверина—вератровую кислоту (обнаруживается в моче более чем через 44 ч после приема) или выявить наличие нативной молекулы мебеверина.
Цель исследования — разработка методики пробоподготовки биологических жидкостей (крови) и обнаружения мебеверина для исключения получения недостоверных результатов при диагностике наркотического опьянения.
Материал и методы
Материалом для исследования служили: препарат «Мебеверин» (НАО «Северная звезда», Россия), ферменты трипсин, химотрипсин и гиалуронидаза (ООО «Самсон-Мед», Россия); папаин (ООО «Вектон»), кровь здоровых доноров, не употреблявших в течение нескольких месяцев лекарственные и наркотические вещества.
Анализ полученных извлечений проводили с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в сочетании с масс-спектрометрией (МС) (ВЭЖХ-МС)/МС на модульном жидкостном хроматографе Nexera XR с тандемным масс-спектрометром LCMS-8050 (Shimadzu). Условия хроматографирования: колонка Shim-pack FC-ODS (2 мм × 150 мм × 3 мкм), термостатированная при 40 °C. Элюирование компонентов смесей осуществляли с помощью бинарного элюента, состоящего из фаз A (0,3 объемных процента муравьиной кислоты в воде) и B (ацетонитрил) согласно следующей программе: 5% фазы B (2 мин); линейный градиент до 100% B (10 мин); сохранение состава (2 мин). Скорость подвижной фазы задавали 0,32 мл/мин, объем вводимой пробы составлял 0,5 мкл. Масс-спектрометр конфигурировали для работы в режиме электрораспылительной ионизации (ESI) в следующих условиях: скорости потоков газа-распылителя и осушающего газа (азот) — 1,5 и 10 л/мин соответственно; температура линии десольватации и нагревательного блока — 250 и 300 °C соответственно; напряжение на интерфейсе — 4,5 кВ, давление газа для ячейки соударений (аргон) — 230 кПа. В качестве аналитического отклика применяли площади пиков, измеряемые при регистрации спектров ионов-продуктов с энергией соударений 22 эВ.
Анализ проводили методом газовой хроматографии с моноквадрупольным масс-спектрометром QP-2020 (Shimadzu, Япония) (ГХ/МС). Условия хроматографирования: капиллярная колонка HP-5ms (30 м × 0,25 мм × 0,25 мкм). Начальная температура колонки составляла 50 °C с выдержкой 0,5 мин, подъем температуры до 150 °C со скоростью 20 °C/мин, подъем температуры до 290 °C со скоростью 12°C/мин с выдержкой при конечной температуре 15 мин; температура испарителя и интерфейса связи с масс-спектрометром — 260 и 290 °C соответственно; скорость потока газа-носителя (гелий) — 1 мл/мин; объем вводимой пробы — 1 мкл (в режиме без деления потока). Масс-спектрометр использовали в условиях электронной ионизации (EI, 70 эВ) при регистрации полного ионного тока (TIC, 40—550 m/z). Для обработки результатов применяли систему обработки хроматомасс-спектральной информации AMDIS и подтверждали идентификацию компонентов с помощью библиотеки масс-спектров NIST11.
Количественное определение мебеверина в извлечениях выполняли по градуировочному графику. Градуировочный график имел линейную зависимость в диапазоне концентраций (10—200 мкг/мл), 0,99≤R≤1,0. Относительное стандартное отклонение (RSD%) сходимости результатов количественного определения не превышало 2%, RSD% прецизионности не превышало 2%, открываемость находилась в диапазоне 99,5—100,5%, что соответствует критерию приемлемости.
Внутрилабораторная (промежуточная) прецизионность валидируемых методик оценивалась в условиях работы одной лаборатории, но в разные дни и разными исполнителями. Относительное стандартное отклонение (RSD,%) не превышало 6,55%, что соответствует критерию приемлемости 15% [8—10].
Жидкость-жидкостную экстракцию (ЖЖЭ) мебеверина из водного раствора осуществляли по следующей схеме: к серии 0,1 мг/мл водных растворов порошка из капсулы лекарственного средства после фильтрации нерастворенных вспомогательных веществ прибавляли по каплям 3 М раствор хлористоводородной кислоты и устанавливали до pH=2; 4; 5; 6; 7 и 10% раствора аммиака до значения pH=8; 9; 10 по pH-метру. Из полученных растворов проводили экстракцию 4 мл хлороформа в мультиротаторе 15 мин со скоростью 50 об/мин, без виброрежима. Отделяли хлороформный слой, полученные извлечения упаривали, сухой остаток анализировали.
Проводили ферментативный гидролиз водного раствора мебеверина: к 5 мл раствора мебеверина прибавляли 5 мл 0,5 мг/мл раствора трипсина или химотрипсина (в 0,1 М раствор аммония гидрокарбоната с pH=7,9), или 2 мг/мл раствора гиалуронидазы (в ацетатном буфере с pH=4,7), или 0,5 мг/мл папаина (в ацетатном буфере с pH=4,5 в присутствии 1 мл 0,002 М раствора трилона Б и 1 мл 0,1% раствора цистеина). Полученные растворы термостатировали 1 ч, гиалуронидазу — 3 ч при температуре 37 °C. К полученным образцам добавляли 5 мл хлороформа, центрифугировали 10 мин со скоростью 3000 об/мин. Хлороформное извлечение отделяли и выпаривали, сухой остаток анализировали [12—15].
Получали модельный комплекс крови с раствором мебеверина по методике Чегера [12]: к 2,5 мл донорской крови прибавляли 2,5 мл 0,1 мг/мл раствора мебеверина гидрохлорида в фосфатном буфере (pH=7,4), термостатировали 1 ч при температуре 37 °C и проводили его ферментативный гидролиз по методикам, указанным выше для водных растворов.
Полученные данные обрабатывали по методам математической статистики в соответствии с рекомендациями Государственной фармакопеи РФ XIV 1.1.0013.15 «Общая фармакопейная статья «Статистическая обработка результатов химического эксперимента», рекомендациями Евразийского экономического союза и FDA (Управления по контролю пищевых продуктов и лекарственных средств США) к валидации биоаналитических методик [9—11] с помощью программы Microsoft Excel 2010. Рассчитывали среднее значение и стандартное отклонение показателей в каждой исследуемой группе. Статистическую значимость различий оценивали с вероятностью p<0,1.
Результаты и обсуждение
Наиболее часто используемыми в практике химико-токсикологических и судебно-химических лабораторий являются методы газовой и жидкостной хроматографии с масс-селективным детектированием [16, 17]. Каждый из этих методов имеет свои достоинства и ограничения в зависимости от вида биологического объекта, из которого получено извлечение, и возможных целевых токсикантов. На первом этапе настоящего исследования проводили выбор метода анализа.
При исследовании нативного мебеверна методом ГХ-МС на хроматограмме наблюдали три пика, которые по библиотеке прибора были идентифицированы как нативный мебеверин (время удерживания 6,9 мин), мебевериновый спирт (время удерживания 7,3 мин) и вератровая кислота (время удерживания 7,7 мин) (рис. 1), следовательно нативная молекула мебеверина подвергалась деструкции в инжекторе хроматографа.
Рис. 1. Хроматограмма (а) мебеверина и масс-спектр (б), полученные при использовании метода ГХ-МС.
Как видно на рис. 2, при исследовании нативного мебеверина методом ВЭЖХ-МС/МС на хроматограмме наблюдается один пик со временем удерживания 4,3 мин и масс-спектром, соответствующий мебеверину. В связи с этим именно этот метод был выбран для дальнейших исследований.
Рис. 2. Хроматограмма (а) и масс-спектр (б) мебеверина, полученные при использовании метода ВЭЖХ-МС/МС.
Выбор оптимального значения pH среды для ЖЖЭ проводили в диапазоне от 2 до 10. Полученные результаты представлены в табл. 1.
Таблица 1. Результаты определения оптимальных условий экстракции мебеверина
| pH | Метрологическая характеристика степени экстракции мебеверина из водных растворов, % | |||
| X±ΔX | S | ε, % | RSD, % | |
| 2 | 85,62±0,99 | 0,39 | 1,16 | 0,45 |
| 4 | 88,85±1,66 | 0,65 | 1,87 | 0,73 |
| 5 | 78,18±1,02 | 0,40 | 1,31 | 0,51 |
| 6 | 74,60±2,06 | 0,80 | 2,77 | 1,08 |
| 7 | 72,60±1,14 | 0,44 | 1,57 | 0,61 |
| 8 | 15,02 ±0,60 | 0,23 | 3,97 | 1,54 |
| 9 | 14,20 ±1,13 | 0,44 | 7,93 | 3,09 |
| 10 | 14,07 ±0,11 | 0,15 | 0,08 | 1,08 |
Как видно из данных табл. 1, несмотря на основные свойства мебеверина (рКа=9,48), наибольшая степень экстракции целевого аналита была получена в интервале pH от 2 до 4. При повышении значения pH раствора степень экстракции понижалась, а при переходе к щелочным значениям, особенно выше pH ≥8, на хроматограмме наблюдались 2 пика, что указывает на щелочной гидролиз нативной молекулы мебеверина в данных условиях. В результате гидролиза степень экстракции нативного аналита существенно снижалась до 14—15%. Провести количественную оценку других продуктов гидролиза не представлялось возможным из-за отсутствия соответствующих стандартов для градуировки прибора.
Исследования устойчивости мебеверина в водном растворе в условиях ферментативного гидролиза показали его разрушения (рис. 3); на хроматограмме наблюдались пики значительной интенсивности со временем 3,6 мин, что соответствует вератровой кислоте, пик со временем удерживания 4,3 мин и масс-спектром, соответствующий нативному мебеверину. Также были отмечены пики низкой интенсивности со временем удерживания 3,3 мин, что соответствует п-метоксиамфетамину, и пик (п-метоксиэтиламфетамин, 3,4 мин), которые являются продуктами гидролиза мебеверинового спирта.
Рис. 3. Хроматограмма извлечения из водного раствора мебеверина после ферментативного гидролиза (ВЭЖХ-МС/МС).
Результаты ЖЖЭ использованием крови представлены в табл. 2.
Таблица 2. Результаты статистической обработки данных количественного определения мебеверина в извлечениях (ЖЖЭ хлороформом при pH=3) из модельных образцов крови
| pH при экстракции | Метрологическая характеристика степени экстракции, % | |||
| X±ΔX | S | ε, % | RSD, % | |
| 3 | 34,83±1,00 | 0,51 | 2,86 | 1,42 |
| 6 | 24,50±1,42 | 0,71 | 5,82 | 2,89 |
| 9 | 6,13±1,01 | 0,50 | 16,44 | 8,16 |
Как и в эксперименте с водными растворами, наибольшая степень экстракции была зарегистрирована при pH=3–34,83±1,00%. При pH=6 степень экстракции снижалась, а при переходе в щелочную область (pH=9) резко падала.
Результаты проведения пробоподготовки ферментативным гидролизом модельных образцов крови представлены в табл. 3.
Таблица 3. Результаты статистической обработки данных количественного определения мебеверина при проведении пробоподготовки ферментативным гидролизом и ЖЖЭ хлороформом при pH=3
| Фермент | Метрологическая характеристика степени экстракции, % | |||
| X±ΔX | S | ε, % | RSD, % | |
| Трипсин | 33,33±1,01 | 0,50 | 3,02 | 1,50 |
| Химопсин | 49,45±1,42 | 0,71 | 2,88 | 1,43 |
| Химотрипсин | 35,09±1,42 | 0,71 | 4,06 | 2,02 |
| Гиалуронидаза | 58,55±1,01 | 0,50 | 1,72 | 0,85 |
| Папаин | 55,55±1,04 | 0,52 | 1,88 | 0,93 |
Несмотря на то что (как было показано выше) мебеверин в водном растворе частично гидролизуется в условиях протеолиза, отмечалось существенное увеличение степени экстракции целевого аналита из крови, особенно при использовании папаина и гиалуронидазы. Степень экстракции увеличивалась примерно 1,5—1,6 раза по сравнению с прямой ЖЖЭ (без разрушения комплекса альбумин/токсикант) и составляла 55,55±1,04 и 58,55±1,01% соответственно. Этот факт объясняется тем, что протеолизу подвергается именно комплекс альбумин/мебеверин, а не сама нативная молекула мебеверина, которая, как показали результаты настоящего исследования, является очень лабильной в щелочной среде и при термическом воздействии.
Выводы
1. Результаты исследования показали, что для обнаружения мебеверина в крови требуется применение селективной методики пробоподготовки, которая состоит в проведении экстракции при pH=2—4 среды водной фазы и ферментативного гидролиза папаином или гиалуронидазом при извлечении из крови.
2. Доказано, что при значениях pH-среды больше 9 происходит гидролиз нативного мебеверина до вератровой (3,4-диметоксибензойной) кислоты и мебеверинового спирта.
3. Показано, что исследование извлечений на мебеверин необходимо проводить методом ВЭЖХ-МС/МС, что позволит избежать деградации нативного мебеверина в инжекторе хроматографа, которая происходит при анализе с помощью метода ГХ-МС.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.