Пробоподготовка как этап количественного анализа в значительной степени определяет метрологические характеристики аналитической методики. В диагностике острых отравлений и судебно-химической экспертизе при исследовании на наркотические средства, психотропные и лекарственные вещества применяются различные варианты пробоподготовки, среди которых важное место занимает жидкость-жидкостная экстракция биологических жидкостей [1].
Отсутствие единства методических подходов к реализации пробоподготовки приводит к большому разбросу результатов количественного определения наркотических средств и лекарственных веществ хроматографическими методами для часто встречаемых в практике анализируемых веществ в условиях конкретной лаборатории. Оптимизация процедуры жидкость-жидкостной экстракции ряда лекарственных веществ, имеющих токсикологическое значение, является одним из вариантов решения вышеуказанной проблемы [2].
Цель исследования — определение оптимальных условий пробоподготовки крови методом жидкость-жидкостной экстракции с использованием математического планирования эксперимента на примере судебно-химического исследования верапамила.
Материал и методы
В работе использовали стандартный образец верапамила (в форме гидрохлорида) («LGC Standards», Великобритания). Модельные образцы крови готовили путем добавления расчетного количества стандартного образца (в виде метанольного раствора концентрации 10,0 мкг/мл в пересчете на основание) к образцам трупной крови лиц, умерших от механической травмы, не содержащим наркотических средств, психотропных и лекарственных веществ. Образцы крови не консервировали, хранили при температуре +4 °C [3].
Концентрация верапамила в пробах крови составляла 200,0—5000,0 нг/мл.
Пробоподготовку образцов крови осуществляли жидкость-жидкостной экстракцией. Объем пробы крови 10 мл. Условия экстракции: интервалы варьирования значения pH водной фазы, соотношение хлороформа и н-бутанола в экстрагенте, время экстракции (мин), время центрифугирования (мин), наличие/отсутствие электролита натрия хлорида (%), соотношение объемов пробы и экстрагента представлены в табл. 1.
Таблица 1. Уровни варьирования факторов, влияющих на степень извлечения верапамила из образцов крови
| Фактор | Кодированные уровни | ||
| –1 | 0 | +1 | |
| X1 — значение pH водной фазы | 7,0 | 9,0 | 11,0 |
| X2 — соотношение хлороформ—н-бутанол в экстрагенте | 9:1 | 7:3 | — |
| X3 — время экстракции, мин | 2,0 | 5,0 | 10,0 |
| X4 — время центрифугирования, мин | 5,0 | 10,0 | 20,0 |
| X5 — добавление электролита натрия хлорида, % | 10,0 | 5,0 | — |
| X6 — соотношение объемов пробы и экстрагента | 1:1 | 1:2 | 2:1 |
Полученные экстракты упаривали до сухого остатка в токе азота при температуре не более 40 °C. Сухой остаток растворяли в 50 мкл смеси хлороформ-этанол (1:1).
Исследование полученных экстрактов осуществляли на газовом хроматографе Agilent Technologies 6890 с масс-селективным детектором Agilent Technologies 5973N с использованием кварцевой капиллярной колонки HP5-MS (5% фенилдиметилсилоксан) длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм с толщиной пленки неподвижной фазы 0,25 мкм. Режим программирования температуры колонки: начальная температура 170 °C (выдержка в течение 1 мин), повышение температуры со скоростью 15 °C/мин до 280 °C с выдержкой при конечной температуре 5 мин. В качестве газа-носителя использовали гелий; скорость газа-носителя 1 мл/мин в режиме постоянного потока. Температура инжектора 280 °C, температура аналитического интерфейса 285 °C. Ввод пробы осуществляли с помощью автосамплера в режиме без деления потока со сбросом избытка через 1 мин в отношении потоков 1:15 (split/splitless); объем пробы 1 мкл [4].
При хромато-масс-спектрометрическом анализе регистрировали характеристические ионы верапамила — 151, 260, 303 (режим селективного ионного мониторинга).
Степень извлечения (СИ, %) определяли путем сравнения аналитических сигналов (площади пика ионной хроматограммы для характеристического иона 303), полученных из двух различных серий образцов крови после жидкость-жидкостной экстракции верапамила. Серию образцов №1 составили экстракты из холостых проб крови, в которые перед экстракцией добавлен верапамил в концентрациях 200,0, 1000,0 и 5000,0 нг/мл. Серию образцов №2 составили аналогичные экстракты из холостых проб крови, в которые верапамил был добавлен после процедуры экстракции [5].
Расчет проводили СИ по формуле:
где: А1 — интенсивность аналитического сигнала для верапамила в пробах серии №1, усл.е., А2 — интенсивность аналитического сигнала для верапамила в пробах №2, усл.е.
В качестве параметра оптимизации была выбрана степень извлечения верапамила из исследуемой пробы (эффективность экстракции, %). Основные факторы, влияющие на параметр оптимизации: значение pH водной фазы, соотношение хлороформ—н-бутанол в экстрагенте, время экстракции (мин), время центрифугирования (мин), добавление электролита натрия хлорида (%), соотношение объемов пробы и экстрагента.
Оценку степени извлечения верапамила проводили по схеме многофакторного трехуровневого планирования эксперимента с применением плана Бокса—Бенкена (6 факторов, 1 блок, 54 опыта), статистическую обработку данных выполняли с помощью программы Statistica 10.0. Уровень доверительной вероятности принимали равным 95%. Для получения математической модели процесса жидкость-жидкостной экстракции верапамила реализована одна повторность плана после его рандомизации [6, 7].
Результаты и обсуждение
Для анализируемого лекарственного вещества был получен массив данных по величине степени извлечения методом жидкость-жидкостной экстракции в соответствии с планом эксперимента. Статистические характеристики данных степени извлечения верапамила из проб крови представлены в табл. 2. После исключения промахов из массива данных выборка в большей степени соответствовала закону нормального распределения: распределение результатов эффективности экстракции стало более симметричным, уменьшилось значение эксцесса (по модулю), также его отрицательное значение свидетельствовало о «закругленности» графика распределения полученных величин.
Таблица 2. Статистические характеристики данных эффективности экстракции верапамила из крови
| Выборка | Объем выборки, n | Среднее значение, xсред | Медиана, m | Стандартное отклонение, S | Асимметрия | Эксцесс | Уровень значимости p критерия Колмогорова—Смирнова |
| До исключения промахов | 54 | 78,88 | 79,82 | 9,00 | -0,78 | 0,33 | >0,2 |
| После исключения промахов | 48 | 81,17 | 80,56 | 6,45 | -0,17 | -0,16 | >0,2 |
Уровень значимости критерия Колмогорова—Смирнова p составил >0,2, что подтверждает возможность аппроксимации полученного экспериментального распределения законом нормального распределения.
На рис. 1 показана визуальная оценка соответствия распределения массива данных эффективности экстракции верапамила из проб крови кривой нормального распределения Гаусса.
Рис. 1. Гистограмма распределения данных эффективности экстракции верапамила из крови.
Математическая модель, описывающая зависимость ключевого параметра оптимизации от значений влияющих факторов, представлена функцией ω=f(X1, X2, X3, X4, X5, X6). Для проверки уравнения регрессии рассчитан коэффициент множественной корреляции (r), его значение 0,73, что свидетельствует о сильной связи между эффективностью экстракции верапамила и набором факторных показателей (рассматриваемых параметров жидкость-жидкостной экстракции).
Для того, чтобы оценить, какая часть вариации результативного показателя связана с вариацией факторных показателей, необходим коэффициент детерминации (r2). Коэффициент принимает значения от 0 до 1, и чем ближе значение коэффициента к 1, тем сильнее зависимость, причем при r2>0,5 математическую модель следует считать приемлемой. Величина коэффициента детерминации r2 для анализируемой выборки равна 0,53, что интерпретируется как хорошее соответствие модели экспериментальным данным и указывает на высокую точность аппроксимации.
Статистическую надежность множественной регрессии оценивали с помощью критерия Фишера (F-критерия), который проверяет нулевую гипотезу о статистической незначимости параметров регрессионного уравнения. Для этого сравнивали фактические значения F-критерия с табличным (Fтабл) при заданном уровне значимости и числе степеней свободы. В нашем эксперименте критерий Фишера Fтабл (df1=6 и df2=48) имеет значение 2,29, а полученное фактическое значение Fфакт составило 2,31.
Таким образом, в проведенном регрессионном анализе для экстракции верапамила фактическое значение Fфакт превышает значение Fтабл. Это свидетельствует о том, что с вероятностью 95% полученные данные не являются случайными и сформированы под воздействием существенных факторов.
Выборочная дисперсия (SS) не превышает значения 6,45.
Математическая модель жидкость-жидкостной экстракции верапамила из проб крови имеет вид уравнения множественной линейной регрессии:
ω = 74,55 + 0,71×X1 – 0,087×X2 – 0,19×X3 + 0,048×X4 + 0,13×X5 + 0,23×X6,
где ω — степень извлечения верапамила из пробы крови.
Из представленного уравнения следует, что при жидкость-жидкостной экстракции наиболее выраженное влияние на извлечение верапамила оказывает только фактор X1 — значение pH водной фазы.
С целью визуализации изучаемого процесса и представления взаимодействий факторов, определяющих эффективность экстракции верапамила, использовали карты Парето для стандартизованных эффектов (рис. 2).
Рис. 2. Карта Парето стандартизованных эффектов для экстракции верапамила из проб крови (L — линейные эффекты, Q — квадратичные эффекты).
Анализ карты Парето подтверждает значимое влияние значения pH водной фазы на эффективность экстракции верапамила. В меньшей степени на процесс экстракции влияют добавление электролита, время экстракции и соотношение объемов пробы и экстрагента. Другие факторы экстракции существенного влияния не оказывают. Например, добавление к хлороформу н-бутанола в соотношении 9:1 и 7:3 не приводит к увеличению степени извлечения верапамила.
Поверхности отклика и контурные диаграммы наглядно демонстрируют влияние комбинаций исследуемых факторов на эффективность экстракции.
Из представленных на рис. 3 диаграмм следует, что сочетание значения pH водной фазы 9,5—10,0 и добавление натрия хлорида в диапазоне концентраций 4—6% обеспечивают максимальную степень извлечения верапамила из проб крови.
Рис. 3. Поверхность отклика (а) и контурная диаграмма (б) зависимости эффективности экстракции верапамила от факторов Х1 и Х5.
Заключение
Таким образом, показано влияние исследуемых факторов: значения pH водной фазы, соотношения хлороформа и н-бутанола в экстрагенте, времени экстракции и центрифугирования, добавления электролита натрия хлорида, соотношения объемов пробы и экстрагента на степень извлечения верапамила из крови в судебно-химической экспертизе. Основными факторами, определяющими экстракцию целевого соединения, являются значение pH водной фазы и добавление натрия хлорида в пробу.
Реализованный нами алгоритм с применением математического планирования и построения модели жидкость-жидкостной экстракции целевого анализируемого соединения носит универсальный характер модельного эксперимента. Его можно рекомендовать для оптимизации процедуры анализа в условиях судебно-химических отделений при исследовании на другие наркотические средства, психотропные и лекарственные вещества.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.