Для сотрудников правоохранительных органов давность наступления смерти (ДНС) играет ключевую роль в уголовных расследованиях, особенно если на месте преступления отсутствовали свидетели. Точная оценка ДНС может подтвердить показания свидетелей, упростить расследование преступлений, служить важным доказательством в суде. Сегодня ДНС можно определить с помощью различных методов [1—3], каждый из которых может внести потенциально важную информацию, но в то же время имеет ограничения в применении в зависимости от ситуации.

На протяжении многих лет для оценки ДНС использовали судебно-медицинскую энтомологию, основанную на посмертном наблюдении за динамикой колонизации трупа насекомыми. В последние годы накоплены сведения, доказывающие, что микробные сообщества также имеют свою динамику и преемственность в посмертном периоде [4, 5], что может быть использовано в экспертной практике для определения ДНС.

Цель работы — обобщение и актуализация данных современных исследований, посвященных определению ДНС с использованием микроорганизмов, а также раскрытие перспектив для дальнейшего изучения вопроса.

Посмертный микробиом

Посмертный микробиом — сообщество про- и эукариотических микроорганизмов, которые появляются при разложении трупов людей и животных [6]. Его можно разделить на два компонента: танатомикробиом и эпинекротическое микробное сообщество. Первый состоит из микроорганизмов (бактерии и грибы), которые присутствуют в крови и внутренних органах (мозг, сердце, печень, легкие, селезенка); второй состоит из микроорганизмов, проживающих и/или присутствующих на поверхности (кожа, видимые слизистые оболочки, дистальный отдел прямой кишки) трупа. Танатомикробиом является более стабильным, так как в меньшей степени подвержен влиянию как биотических (насекомые, газы), так и абиотических (влажность, температура, pH) факторов [7].

После смерти человека вследствие прекращения работы иммунной системы микроорганизмы, которые присутствуют в пищеварительном тракте, способны вторгаться не только в окружающие органы, но и перемещаться по кровеносной и лимфатической системам, инициируя процесс разложения [8]. По мере развития гнилостной биотрансформации разнообразие микробных сообществ уменьшается, только несколько родов становятся доминирующими, наблюдается переход от аэробных бактерий (Bacteroidetes: Bacteroides и Parabacteroides; Firmicutes: Faecalibacterium, Phascolarctobacterium, Blautia и Lachnospiraceae incertae sedis) к анаэробным (Bacteroidetes: Clostridium; Firmicutes: Peptostreptococcus и Anaerosphaera; Gammaproteobacteria: Wohlfahrtiimonas, Ignatzschineria, Acinetobacter и Providencia) [9].

Попытки разработки способа определения ДНС с помощью микробиома

J.L. Metcalf и соавт. [10] проводили исследование, пытаясь определить так называемые микробные часы для оценки ДНС в эксперименте. Они разработали впечатляющую модель, которая точно отражала смену микробных сообществ на протяжении 48 сут гниения мышей. Следует отметить, что условия окружающей среды поддерживались стабильными, насекомые были удалены из опыта с целью снижения изменчивости окружающей среды. Контролируемая среда является неточной моделью, так как трупы людей нередко обнаруживают после длительного пребывания в неконтролируемых средах.

J.L. Pechal и соавт. [11] сообщили о последовательности бактериальных таксонов в ходе разложения свиней в неконтролируемой среде. Они построили статистическую модель с использованием метагеномной выборки, которая подтвердила последовательность изменений 95% микробиома в ходе гнилостной биотрансформации трупов свиней. Данное исследование продемонстрировало, что тщательный анализ данных может исключить ошибки, возникающие при действии факторов внешней среды. В более раннем исследовании J.L. Pechal и соавт. [12] привели сезонные изменения посмертного микробиома свиней в умеренной климатической зоне, что также является важным фактором, который может влиять на определение ДНС в условиях посмертного оледенения. D.O. Carter и соавт. [13] доказали, что почвенные микроорганизмы вносят существенный вклад в экосистему разложения трупов свиней, что также необходимо учитывать при диагностике ДНС.

K.L. Cobaugh и соавт. [14] и S.J. Finley и соавт. [15] сообщили, что микробные сообщества трупа и почвы сливаются в одну динамическую систему. Было доказано также, что микроорганизмы трупа могут обнаруживаться в близлежащей почве до года и, возможно, гораздо дольше. Важно отметить, что трупные микроорганизмы в почве характеризуются циклическим развитием, что может помочь в определении ДНС даже после длительного отсутствия трупа на месте преступления.

K.A. Hauther и соавт. [16] многократно брали образцы бактерий из толстой кишки 12 трупов во время их разложения в неконтролируемой среде. Провели количественный анализ бактериальных сообществ с использованием гена 16S рРНК для филогенетической идентификации. Идентифицировали три конкретных рода бактерий, которые продемонстрировали определенные перспективы в качестве маркеров определения ДНС. Похожие исследования проводили и другие авторы [17, 18]. По результатам мониторинга состояния сообщества протеолитиков во времени и пространстве доказана возможность использования протеолитиков как маркера для определения ДНС в позднем постмортальном периоде. Доказано также, что при изучении скелетированных трупов результаты энтомологического и микробиологического исследований являются перспективным направлением в области судебной медицины при установления ДНС.

H.R. Johnson и соавт. [19] исследовали бактериальные образцы из ноздрей и ушных каналов 17 трупов и проанализировали их с помощью секвенирования гена 16S рРНК. Выявили отрицательную корреляцию между разнообразием микрофлоры в ушных раковинах и сроком постмортального периода, а для микрофлоры носа была характерна противоположная картина.

Микробиом кожи человека персонализирован и уникален. Он напрямую зависит от контактов с различными объектами либо от конкретного места, где находился человек [20, 21]. После смерти персонализированные микробные сообщества заменяются другими, для которых более благоприятна среда разложения. Точные сроки такой замены неизвестны, но имеются исследования, в которых сообщается о первых 48 ч после смерти, если труп изолирован от действия факторов окружающей среды [22, 23]. В большинстве исследований, посвященных изучению посмертной динамики микробиома для определения ДНС, которые были приведены ранее, трупы размещали на открытом пространстве, что, вероятно, способствовало появлению другого микробного сообщества и более быстрому разложению [24]. Таким образом, учитывая этот факт, можно сделать вывод, что «микробные часы» можно применить до 48 ч после смерти в случае обнаружения трупа в закрытом пространстве.

Факторы, влияющие на посмертный микробиом, и их анализ

Температура

Температура окружающей среды влияет на состав посмертного микробиома как качественно, так и количественно. Различные микроорганизмы имеют оптимумы своего роста, следовательно, численность и состав микроорганизмов во внутренних органах зависят от температуры трупа, которая играет важную роль в оценке ДНС [25]. Для высокой температуры характерна повышенная скорость разложения трупа в результате усиленной активности микробных ферментов — протеаз и фосфодиэстераз [26]. Следовательно, температура окружающей среды является фактором, который необходимо учитывать при оценке ДНС с помощью посмертного микробиома.

pH

Человеческий труп претерпевает множество физиологических изменений вследствие лизиса клеток, включая изменение pH, которое играет важную роль в определении численности и состава посмертного микробиома. A.E. Donaldson и соавт. [27] доказали, что pH трупа составляет в среднем 5,1, что способствует росту ацидофильной флоры. Дополнительный фактор, снижающий pH, — выделение гнилостных газов [28]. Значимым для оценки ДНС является выделение ацидофильной бактерии Methyloferula stellate [4]. Кислая среда также способствует росту многих липофильных комменсалов на коже: Propionibacterium acnes, сем. Malassezia [29]. Ацидофилы синтезируют ферменты: амилазы, протеазы, лигазы, целлюлазы, ксиланазы, альфа-глюкозидазы, эндоглюканазы и эстеразы, которые стабильны при низком pH, что можно использовать для определения ДНС [30]. Напротив, в эксперименте с моделированием разложения скелетных мышц сообщалось, что продукты распада изменяли почвенную среду на щелочную [31]. Данный фактор является неотъемлемым в изучении посмертного микробиома и обязательно должен быть учтен в последующих исследованиях.

Влажность

Труп разлагается быстрее при повышенной влажности, чем в холодных и сухих местах, поэтому данный фактор влияет на микробное сообщество. Относительная влажность оказывает большое влияние на терморегуляцию и кровообращение человеческого тела [32]. Большинству микроорганизмов для роста требуется 60% относительной влажности, но некоторые виды способны выживать при менее 20%, однако низкая температура и влажность ограничивают их рост [33]. Бактериальное сообщество кожи обладает высокой устойчивостью к влажности и другим экологическим факторам [7], следовательно, они могут являться более точным маркером для определения ДНС.

Употребление антибиотиков и других лекарственных средств

Длительное использование антибиотиков изменяет комменсальную микрофлору человеческого организма, дисбиотический микробиом не выполняет необходимые функции: например, участие в пищеварении, выработку витаминов и защиту от патогенов [34]. Некоторые антибиотикорезистентные микроорганизмы способны колонизировать кишечник и изменять его нормальную микрофлору [35]. A.V. Vila и соавт. [36] показали, что применение слабительных средств снижает содержание бифидобактерий в кишечнике и повышает количество бактероидов. Таким образом, употребление лекарственных средств изменяет нормальную микрофлору человеческого тела. Исследование более 1000 неантибиотических препаратов показало, что 240 (24%) из них подавляют по крайней мере один комменсальный штамм микрофлоры кишечника [37]. Интересно отметить, что род Clostridium превалирует в посмертном микробиоме при наступлении смерти от передозировки наркотическими средствами [38]. Таким образом, при определении ДНС с помощью микробиома по возможности необходимо учитывать факт употребления антибиотиков и/или иных лекарственных средств незадолго до смерти.

Факторы индивидуальности

На процесс разложения человеческого тела влияет физическое состояние человека. Труп с большим количеством жира более устойчив к процессу деградации, тем не менее наличие большого количества жира создает питательную среду для роста разлагающих микроорганизмов. В связи с этим процесс разложения трупов с излишним количеством жира начинается стремительно, но процесс скелетирования таких тел занимает больше времени [39]. C.R. Bell и соавт. [40] провели интересное исследование и выявили преобладание Streptococcus sp. в сердечной мышце у мужчин, в то время, когда у женщин преобладали Clostridium sp. и Pseudomonas sp. Отсюда появляется новый вопрос о половых различиях в посмертном микробиоме. Таким образом, необходимо более подробно изучить влияние факторов индивидуальности на посмертный микробиом, прежде чем уверенно указывать ДНС.

Заключение

Исследование посмертного микробиома — относительно новый, стремительно развивающийся инструмент с потенциальной пользой для судебной медицины. Оценка времени, прошедшего с момента смерти, на основании посмертного микробиома имеет большой потенциал для точного определения ДНС, однако у всех предложенных на сегодняшний день методов есть ограничения. Динамика изменения микробных сообществ вследствие влияния множества внешних и внутренних факторов значительно усложняет процесс интерпретации результатов. Смена микробных сообществ в человеческом трупе показала многообещающие результаты для оценки ДНС, но в настоящее время отсутствуют доказательства повторяемости такой преемственности в различных географических и экологических условиях. Актуально проведение новых масштабных исследований с учетом всех факторов, которые могли бы повлиять на посмертный микробиом.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.