Разработка методик определения и изучение сохраняемости 2,4-диметилгидроксибензола и 2,6-диметилгидроксибензола в биологическом материале

2,4-Диметилгидроксибензол (2,4-диметилфенол, 2,4-ксиленол; далее 2,4-ДМГОБ) и 2,6-диметилгидроксибензол (2,6-диметилфенол, 2,6-ксиленол; далее — 2,6-ДМГОБ) известны как антиоксиданты, анестетики и антисептики, входят в ряд эфирных масел и применяются в органическом синтезе. 2,4-ДМГОБ проявляет свойства фунгицида, его можно использовать в медицинской и сельскохозяйственной практике [1—5]. 2,6-ДМГОБ — продукт биотрансформации мексилетина [6]. 2,4-ДМГОБ — бесцветная прозрачная жидкость (t_кип=211,5 °C) или бесцветные кристаллы (t_пл=27—28 °C) со своеобразным запахом, плохо растворимы в воде (0,5375 г/100 г при температуре 20 °C).

2,6-ДМГОБ — бесцветные кристаллы (t_пл=49 °C), имеющие характерный запах. В 100 г воды при температуре 25 °C растворяется 604,7 мг 2,6-ДМГОБ. Растворяются 2,4-ДМГОБ и 2,6-ДМГОБ в водно-щелочных растворах, низших алканолах, этилацетате, этоксиэтане, трихлорметане [7—9].

Вещества токсичны для теплокровных. Величина LD₅₀ 2,4-ДМГОБ и 2,6-ДМГОБ для крыс при пероральном поступлении составляет соответственно 3200 и 296 мг/кг, при перкутанном — 1040 и 2325 мг/кг; для мышей при пероральном введении — 809 и 450 мг/кг, при интраперитонеальном — 183 и 150 мг/кг соответственно [8—10].

Рассматриваемые диметилгидроксибензолы входят в число важных экотоксикантов [11—16].

В научной литературе имеются сведения об отравлениях людей 2,4-ДМГОБ и 2,6-ДМГОБ, приведены случаи летального исхода [17—20].

Описан смертельный случай отравления мексилетином, метаболитом которого может быть 2,6-диметилгидроксибензол [21].

Разнообразное применение, токсические свойства 2,4-ДМГОБ и 2,6-ДМГОБ и наличие случаев летального отравления данными веществами определяют их важное химико-токсикологическое значение. Некоторые вопросы судебно-химического анализа 2,4-ДМГОБ и 2,6-ДМГОБ остаются недостаточно разработанными. В частности, относительно мало изучены методы определения этих веществ в различных биоматрицах. Практически отсутствуют сведения по сохраняемости этих диметилгидроксибензолов в биологическом (трупном) материале.

Цель работы — изучение особенностей определения и сохраняемости 2,4-ДМГОБ и 2,6-ДМГОБ в биологическом материале.

Объекты исследования — 2,4-ДМГОБ и 2,6-ДМГОБ производства фирмы «Aldrich», содержащие соответственно 98 и 99,5% и более основного вещества.

Использовали модельные смеси соединений с тканью печени. Изучили особенности определения содержания аналитов в биологическом материале, разработали и валидировали методики определения диметилгидроксибензолов.

В режиме настаивания выполнили сравнительное изолирование рассматриваемых соединений из биологического материала 13 органическими растворителями, водой и водными растворами кислой и щелочной реакции по схемам, описанным ранее для соединений близкой структуры [22].

Определили оптимальный изолирующий агент и наиболее приемлемые условия изолирования данным изолирующим агентом.

Оценили возможности очистки 2,4- и 2,6-диметильных производных гидроксибензола, извлекаемых из биоматериала. Методом жидкость-жидкостной экстракции (ЖЖЭ) исследовали особеннности распределения данных веществ между водной и органической фазами в зависимости от природы органической фазы, значения pH водного слоя, влияния эффекта высаливания и насыщения органической фазы водой, продолжительности и кратности динамического контакта фаз. Характер распределения аналита между фазами оценивали по его количеству в органической фазе, которое определяли спектрофотометрическим методом (прибор СФ-2000; l=1 см).

С целью поиска дополнительных вариантов очистки аналитов от эндогенных веществ биоматриц изучили характер хроматографической подвижности 2,4-ДМГОБ и 2,6-ДМГОБ в полупрепаративной (190×10 мм) колонке силикагеля L 40/100 мкм при элюировании мало- и среднеполярными подвижными фазами.

Аналиты вводили в колонку по 5—10 мг в виде 2 мл раствора в элюенте. Сбор элюата проводили порциями по 2 мл. Присутствие аналита в порциях элюата устанавливали методом спектрофотометрии после разбавления последнего в 20—100 раз 95% этанолом.

Рассмотрели возможность определения 2,4-ДМГОБ и 2,6-ДМГОБ в очищенных извлечениях методами тонкослойной хроматографии (ТСХ) (идентификация), УФ-спектрофотометрии (идентификация и количественное определение) и газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ-МС) (идентификация).

Изучили особенности хроматографического поведения аналитов в присутствии близких органических структур в тонком слое нормальнофазового сорбента СТХ-1-А (пластины «Сорбфил» ПТСХ-АФ-А-УФ).

Исследовали характер поглощения обоими аналитами УФ-излучения (λ=200—360 нм) в различных средах (прибор СФ-20004 l=1). По интенсивности поглощения в области длинноволнового максимума спектра в оптимальной поглощающей среде определяли количественное содержание аналитов по уравнениям градуировочных графиков.

Изучили хроматографическую подвижность 2,4-ДМГОБ и 2,6-ДМГОБ в капиллярной колонке с жидкой неподвижной фазой при использовании инертного газа-носителя, а также особенности масс-спектров хроматографируемых аналитов. Хроматографировали на приборе Agilent Technologies 6850 Network GC System с масс-спектрометрическим детектором модели 5973 Network. Вид ионизации молекул — электронный удар с энергией 70 эВ. Сигнал регистрировали по полному ионному току.

По результатам предварительных исследований разработали методики определения наличия 2,4- и 2,6-диметильных производных гидроксибензола в ткани трупного органа (печень).

С помощью разработанных методик изучили динамику разложения 2,4-ДМГОБ и 2,6-ДМГОБ в биологическом материале. Для этого готовили модельные смеси веществ с измельченной печенью (0,1 г вещества на 100 г биоматрицы).

Смеси сохраняли в четырех температурных режимах (0—2 °C, 8—10 °C, 20—22 °C и 36 °C). В таких же условиях сохраняли образцы печени, не содержащие аналитов.

Модельные смеси и контрольные образцы исследовали на присутствие в них 2,4-ДМГОБ и 2,6-ДМГОБ через определенные промежутки времени с момента их приготовления.

Результаты исследования показали, что оптимальным изолирующим агентом для извлечения 2,4-ДМГОБ и 2,6-ДМГОБ (рис. 1) из биоматериала можно считать смесь этилацетат-ацетон (7:3 по объему). Наиболее приемлемыми условиями изолирования рассматриваемых диметилгидроксибензолов этой смесью являются двукратное настаивание, массовое соотношение изолирующего агента и биоматериала 2:1 и продолжительность каждого этапа настаивания 30 мин.

Рис. 1. Результаты сравнительного изолирования 2,4-ДМГОБ (а) и 2,6-ДМГОБ (б) (R, %) из биологического материала.

Fig. 1. Results of comparative isolation of 2.4-dimethylhydroxybenzene (a) and 2.6-dimethylhydroxybenzene (b) (R, %) from biological material.

На основе изучения характера распределения аналитов в системах из двух несмешивающихся фаз показано, что в молекулярной форме наиболее полно оба вещества извлекаются из водного слоя этилацетатом при pH водной фазы 2,0—8,0 в условиях ее насыщения электролитом (натрия хлорид). В ионизированной (фенолят-ионы) форме аналиты лучше всего извлекаются из органической фазы (гексан или диэтиловый эфир) водно-щелочным раствором pH 12,0—13,0.

Исследование особенностей хроматографической подвижности 2,4-ДМГОБ и 2,6-ДМГОБ в полупрепаративной колонке силикагеля позволило установить, что оптимальным элюентом в данном случае является малополярная смесь растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (80:5:1). При хроматографировании в данных условиях 2,4-ДМГОБ и 2,6-ДМГОБ обнаруживаются соответственно во фракциях элюата №7—13 (13—26 мл) и №17—24 (33—48 мл).

Результаты хроматографирования исследованных соединений и ряда близких химических структур в тонком слое сорбента СТХ-1-А представлены в табл. 1.

Таблица 1. Хроматографическое поведение 2,4- и 2,6- диметильных производных гидроксибензола и близких по структуре веществ в тонком слое силикагеля СТХ-1-А (пластины «Сорбфил» ПТСХ-АФ-А-УФ)

Table 1. Chromatographic behavior of 2.4- and 2.6-dimethyl derivatives of hydroxybenzene and structurally related substances in a thin layer of silica gel CTX-1-A (Sorbfil PTSKh-AF-A-UV plates)

Примечание. 2,4-ДМГОБ — 2,4-диметилгидроксибензол; 2,6-ДТБ-4-МГОБ — 2,6-ди-трет-бутил-4-метилгидроксибензол; ГОБ — гидроксибензол; 2,6-ДМГОБ — 2,6-диметилгидроксибензол; 4-МГОБ — 4-метилгидроксибензол.

Из данных табл. 1 видно, что оптимальными подвижными фазами могут считаться смеси растворителей гексан-бензол (4:6) и гексан-диоксан-пропанол-2 (120:5:1).

Изучение электронных спектров 2,4-ДМГОБ и 2,6-ДМГОБ в различных средах показало, что оптимальной растворяющей средой для спектрофотометрического определения данных соединений можно считать 95% этанол.

Наиболее длинноволновые максимумы, отмечаемые в спектрах 2,4-ДМГОБ и 2,6-ДМГОБ, полученных в среде 95% этанола, располагаются соответственно в области 283 и 276 нм. Значения молярного коэффициента поглощения, рассчитанные для этих максимумов, составляют соответственно 2669 и 1404.

Установили наличие линейной зависимости между интенсивностью светопоглощения (A, ед.оп.пл.) каждого из аналитов в области их длинноволнового максимума и содержанием вещества (C, мкг/мл) в фотометрируемом растворе. Рассчитали уравнения градуировочных графиков, которые имеют вид: A=0,02078∙С+0,04332 (определение 2,4-ДМГОБ) и A=0,01151∙С+0,02162 (определение 2,6-ДМГОБ).

Относительные ошибки среднего результата при определении 2,4-ДМГОБ и 2,6-ДМГОБ в субстанциях (n=6; p=0,95) не превышают 0,9%.

Для определения 2,4-ДМГОБ и 2,6-ДМГОБ методом ГХ-МС целесообразно использовать капиллярные колонки DB-5MS EVIDEX (25×0,2 мм) с тонкой пленкой (0,32 мкм) жидкой неподвижной фазы (5%-фенил)-метилполисилоксана. Пробу вводят с делением потока 1:2. Предложенные условия хроматографирования: температура инжектора 250 °C, интерфейса детектора 300 °C, начальная температура колонки 70 °C выдерживается 3 мин, затем повышается со скоростью 20 °C/мин до 290 °C, подвижная фаза — гелий, скорость подачи гелия — 0,6 мл/мин. Хроматограммы стандартов исследованных веществ, полученные в данных условиях, представлены на рис. 2.

Рис. 2. Хроматограммы (метод ГХ-МС) стандартов 2,4-ДМГОБ (а) и 2,6-ДМГОБ (б), а также этих же веществ, извлеченных из печени (в, г) соответственно.

Fig. 2. Chromatograms (GC-MS method) of (a) 2.4-dimethylhydroxybenzene and (b) 2.6-dimethylhydroxybenzene standards, as well as the same substances extracted from the liver (c, d), respectively.

Как показали эксперименты, значения времени удерживания 2,4-ДМГОБ и 2,6-ДМГОБ в предлагаемых условиях составляют соответственно 7,92±0,04 и 7,60±0,06 мин.

Масс-спектры стандартов аналитов представлены на рис. 3. Как видно из рис. 3, в спектрах 2,4-ДМГОБ и 2,6-ДМГОБ наиболее интенсивными являются сигналы ионов с массами 77, 107 и 122 m/z. Разработанные методики обнаружения аналитов в биологическом материале включают определенную последовательность действий.

Рис. 3. Масс-спектры стандартов и извлеченных из печени 2.4-ДМГОБ (а) и 2.6-ДМГОБ (б).

Fig. 3. Mass spectra of standards and liver-derived 2.4-dimethylhydroxybenzene (a) and 2.6-dimethylhydroxybenzene (b).

Изолирование. 5 г биологического объекта (ткань печени), содержащего 2,4-ДМГОБ или 2,6-ДМГОБ, дважды по полчаса настаивали с порциями (по 10 г) смеси этилацетат-ацетон (7:3 по объему). Извлечения объединяли в выпарительной чашке, растворитель испаряли вначале до объема 0,5—1,0 мл в токе воздуха при температуре 18—22 °C, затем полностью в токе азота.

Очистка извлечений. Остаток растворяли в 10 мл смеси диэтиловый эфир-гексан (1:1), экстрагировали водно-щелочным раствором pH 12,0 (10×2). Экстракты объединяли, подкисляли 24% раствором хлороводородной кислоты до pH 3,0—4,0 и экстрагировали этилацетатом (20×2). Экстракты объединяли в выпарительной чашке, растворитель испаряли в токе воздуха при температуре 18—22 °C до объема 2—3 мл, количественно переносили в мерную колбу вместимостью 5 мл и доводили до метки этилацетатом. Затем 2 мл полученного раствора вводили в полупрепаративную колонку силикагеля L 40/100 мкм и хроматографировали в описанных ранее условиях. Фракции элюата, содержащие 2,4-ДМГОБ или 2,6-ДМГОБ, объединяли, упаривали до объема 2—3 мл, количественно переносили в мерную колбу вместимостью 5 мл и доводили до метки элюентом (исходный раствор).

В выпарительные чашки №1 и №2 вносили соответственно 0,2—2,0 и 1,0 мл исходного раствора и удаляли растворитель в токе азота.

Метод тонкослойной хроматографии (ТСХ). Остаток в чашке №1 растворяли в незначительном количестве хлороформа и количественно переносили на линию старта хроматографической пластины «Сорбфил» в виде полосы. Хроматографировали, применяя подвижную фазу гексан-диоксан-пропанол-2 (120:5:1). Пятна аналитов на хроматограммах проявляли, облучая их УФ-лучами (λ=254 нм). Критерии идентификации каждого аналита — значения Rf и Rs (относительно Rf гидроксибензола). После хроматографирования аналит элюировали из сорбента (участок хроматограммы с пятном вещества) 5 или 10 мл 95% этанола в течение 15 мин.

УФ-спектрофотометрия. Поглощение этанольного элюата исследовали в диапазоне λ=200—360 нм. Критерии идентификации — форма спектральной кривой и положение точек максимумов. По величине оптической плотности в области длинноволнового максимума рассчитывали количество аналита в биоматериале, используя уравнение градуировочного графика каждого из аналитов.

Хромато-масс-спектрометрия (ГХ-МС). Остаток в чашке №2 растворяли в 4 мл хлороформа. Часть (4 мкл) хлороформного раствора отбирали для исследования методом ГХ-МС в условиях, описанных ранее. Критерии идентификации — значение времени удерживания и специфический набор характеристических заряженных частиц в масс-спектре.

Хроматограммы стандартов аналитов 2,4-ДМГОБ и 2,6-ДМГОБ, а также их масс-спектры идентичны хроматограммам и масс-спектрам этих же веществ, извлеченных из биоматериала и очищенных по предлагаемой схеме (см. рис. 2, 3). Валидация предлагаемых методик определения 2,4-ДМГОБ и 2,6-ДМГОБ в биологическом материале с использованием УФ-спектрофтометрии показала их соответствие критериям линейности, правильности, прецизионности и селективности.

Методики обеспечивают предел обнаружения (ПО) и предел количественного определения (ПКО) 2,4-ДМГОБ соответственно на уровне 1 и 2 мг в 100 г биоматериала, 2,6-ДМГОБ — на уровне 1,5 и 3,0 мг в 100 г биоматериала.

Результаты определения аналитов разработанными методиками в модельных смесях с тканью печени представлены в табл. 2. Данные табл. 2 указывают на то, что при содержании аналитов в исследованных смесях в концентрации 0,004—0,05% разработанные методики позволяют определить (89,86—91,82)±(3,22—5,63)% 2,4-ДМГОБ и (79,58—81,94)±(3,29—5,82)% 2,6-ДМГОБ.

Таблица 2. Количественное определение 2,4-диметилгидроксибензола и 2,6-диметилгидроксибензола в модельных смесях с тканью органа (печень)

Table 2. Results of quantitative determination of 2.4-dimethylhydroxybenzene and 2.6-dimethylhydroxybenzene in model mixtures with organ (liver) tissue

Изучение динамики разложения диметилгидроксибензолов в биологическом материале с помощью разработанных методик позволили получить результаты, отраженные в графической форме (рис. 4). Из рис. 4 видно, что продолжительность сохранения обоих аналитов в биоматрице находится в обратно пропорциональной зависимости от температуры сохранения.

Рис. 4. Результаты изучения сохраняемости 2.4-ДМГОБ (а) и 2.6-ДМГОБ (б) в биологическом материале.

Fig. 4. Results of studying the persistence of 2.4-dimethylhydroxybenzene (a) and 2.6-dimethylhydroxybenzene (b) in biological material.

Таким образом, 2,4-ДМГОБ сохраняется в биологическом материале при температуре 0—2 °C, 8—10 °C, 20—22 °C и 36 °C соответственно 402, 379, 358 и 224 сут. Его 2,6-изомер менее устойчив в биоматрице и сроки его сохранения при указанных температурах составляют соответственно 356, 312, 224 и 136 сут.

1. Для изолирования 2,4- и 2,6-диметильных производных гидроксибензола из биологического материала предложено настаивание со смесью этилацетат-ацетон (7:3 по объему).

2. Показана возможность очистки аналитов от эндогенных веществ биоматрицы сочетанием жидкость-жидкостной экстракции и полупрепаративной колоночной хроматографии в силикагеле L40/100 мкм.

3. Разработаны методики определения 2,4-ДМГОБ и 2,6-ДМГОБ в биоматериале с использованием ТСХ, УФ-спектрофотометрии и ГХ-МС.

4. С помощью разработанных методик изучена динамика разложения аналитов в ткани печени.

Установлено, что при температуре 0—36 °C продолжительность сохранения 2,4-ДМГОБ и 2,6-ДМГОБ составляет соответственно 224—402 и 136—356 сут.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.