Тиабендазол [химические названия: 2-(4-тиазолил)1H-бензимидазол; 4-(1H-1,3-бензодиазол-2-ил)-1,3-тиазол; 2-(4-тиазолил)бензимидазол; 4-(1H-бензо[d]имидазол-2-ил)тиазол; торговые названия: арбомект, мертект, биогурд, титусим, текто] представляет собой соединение с высокой биологической активностью. Является противогельминтным средством, применяется в медицинской и ветеринарной практике; используется как антидот при отравлении металлами [1—4].
Тиабендазол применяется в сельском хозяйстве как фунгицид и протравитель системного действия, а также известен как пищевая добавка (консервант) для сохранения свежести Е233 [5—7].
Это белый кристалический порошок с температурой плавления 296—304 °C [3], или 304—305 °C [1], или 300 °C [8].
Растворимость тиабендазола в воде составляет 0,03 г/л, по другим данным — 0,05 г/л (pH 7,0) [1]; в воде, подкисленной до pH 2,0—10 г/л.
Данное соединение хорошо растворимо в диметилсульфоксиде (80 г/л), диметилацетамиде (64,7 г/л), диметилформамиде (39 г/л), малорастворимо в н-гептане (0,01 г/л) и о-ксилоле (0,13 г/л) [3], метаноле (8,28 г/л; 25 °C), 1,2-дихлорэтане (0,81 г/л; 25 °C), ацетоне (2,3 г/л; 25 °C), этилацетате (1,49 г/л; 25 °C) и н-октаноле (3,91 г/л; 25 °C) [8].
Тиабендазол способен растворяться в других органических растворителях (г/100 г): ацетоне — 0,42, этаноле — 0,21, бензоле — 0,023, хлороформе — 0,008 [1].
Значения log P и рКа составляют соответственно 2,47 и 4,64 (25 °C) [8].
Соединение, как и ряд других производных бензимидазола, токсично для человека и теплокровных животных [9, 10].
При пероральном поступлении тиабендазола его летальная доза для овец 1200 мг/кг. Значения LD50 данного вещества при введении per os составляют: для мышей 1350—3810 мг/кг, для крыс 3330 мг/кг (по другим данным 3100—3600 мг/кг), для кроликов 3800 мг/кг (или более 3850 мг/кг).
В хронических экспериментах на крысах летальный исход наблюдается через несколько дней дней при введении 1200 мг/кг ежедневно, а смерть 30% особей наступает в течение месяца при ежедневном введении 400 мг/кг [1].
Имеются указания на летальные отравления людей от передозировок многокомпонентного препарата андипала, содержащего бендазол — близкое к тиабендазолу производное бензимидазола [11, 12].
Токсические свойства тиобендазола, его разнообразное и широкое применение в медицине, сельском хозяйстве, других отраслях, практическая неизученность многих вопросов его химико-токсикологического анализа позволяют считать вещество потенциальным объектом химико-токсикологического исследования.
Многие аспекты выделения из различного рода матриц (в том числе биологических), концентрирования, очистки, идентификации и оценки количественного содержания тиабендазола и близких химических структур остаются недостаточно разработанными [13—17].
Цель исследования — изучение особенностей и разработка методик определения тиабендазола в тканях трупных органов и крови.
Материал и методы
Объек исследования — тиабендазол [2-(4-тиазолил)-1H-бензимидазол, ГСО 7720-99] с содержанием основного вещества 98% и более.
Изучили возможность извлекать анализируемое вещество из биоматериала рядом жидкостей различной химической природы: водными растворами с разными кислотно-основными характеристиками, спиртами, простыми и сложными эфирами, альдегидами, кетонами и карбоновыми кислотами, галогеналканами, ароматическими, азот- и серосодержащими органическими растворителями.
Для определения оптимального изолирующего агента в соответствии с известными методиками готовили искусственные смеси аналита с биоматериалом в соотношении 25 мг порошка тиабендазола и 25 г мелкоизмельченной трупной печени (размер частиц 0,2—0,5 см), тщательно перемешивали и выдерживали 90 мин при комнатной температуре [18—20].
Каждую модельную смесь, содержащую тиабендазол, изолировали соответствующим растворителем, который добавляли в количестве, превышающем массу смеси в 2 раза (двукратно по 45 мин на каждом этапе), далее оба изолята объединяли и пропускали через фильтровальную бумагу, предварительно смоченную соответствующим изолирующим агентом. Точное количество фильтрата хроматографировали в тонком слое сорбента на пластинах «Сорбфил» ПТСХ-АФ-А-УФ (подвижная фаза — толуол-ацетонитрил 2:8) для очистки от соэкстрактивных веществ. Детекцию проводили УФ-облучением, при этом тиабендазол проявлялся в виде темного пятна с Rf=0,53±0,03. Далее аналит элюировали 5 мл ацетонитрила.
Количественное содержание тиабендазола в элюате определяли методом спектрофотометрии по интенсивности поглощения электромагнитного излучения определяемого вещества в УФ-области в точке экстремума при длине волны 301 нм. Количество тиабендазола, выделенное из биологического материала, рассчитывали по уравнению градуировочного графика [21].
Для определения зависимости степени извлечения от кратности и времени изолирования, а также массового соотношения растворителя и биологического материала использовали схему изолирования, очистки, идентификации и оценки количественного содержания определяемого вещества, приведенную ранее.
При полученных оптимальных условиях определяли зависимость степени извлечения тиабендазола от его содержания в исследуемом объекте. Для этого использовали искусственные смеси с содержанием аналита 1,25; 2,5; 5,0; 10,0; 25,0 и 50,0 мг в 25 г биологического материала.
Изучили варианты очистки тиабедазола методом колоночной хроматографии обычного (101,3±7,0 кПа) давления (стеклянная колонка 490×11 мм, заполненная сорбентом L 40—100 мкм массой 10 г; элюент — смесь растворителей ацетон-дихлорметан 9,5:0,5). Элюат собирали фракциями по 2 мл каждая. Аликвоту каждой фракции количественно наносили на пластины «Сорбфил» ПТСХ-АФ-А-УФ и хроматографировали (подвижная фаза — толуол-ацетонитрил (2:8), способ детектирования — облучение УФ-лучами с длиной волны 240 нм).
Параллельно осуществляли контрольный опыт. Фракции, в которых теоретически возможно присутствие тиабендазола, объединяли и испаряли, остаток растворяли в 5 мл ацетонитрила и измеряли оптическую плотность раствора при длине волны 301 нм.
Как возможный вариант предварительного исследования рассмотрели хроматографию в тонком слое сорбента. Тиабендазол и другие производные бензимидазола хроматографировали, используя пластины «Сорбфил» ПТСХ-АФ-А-УФ.
Для подтверждающей идентификации тиабендазола применяли ГХ-МС и УФ-спектрофотометрию.
Метод ГХ-МС воспроизводили, используя хроматограф «Маэстро 7820» с квадрупольным масс-селективным детектором фирмы «Agilent technologies 5977». Пробу вводили, не проводя деление потока. Хроматографирование осуществляли в капиллярной колонке. Анализ проводили в режиме постоянного давления газа-носителя — гелия марки «А». Вариант ионизации — электронный удар с энергией электронов 70 эВ. Напряжение на умножителе: результат, полученный при автоматической настройке по перфторбутиламину в режиме ATUNE. Режим работы масс-селективного детектора (MSD): полное сканирование ионов от 41 до 650 атомных масс (режим SCAN). Масс-спектры по полному ионному току регистрировали после задержки на выходе пика растворителя через 3 мин после ввода. Полученные масс-спектры сравнивали с библиотечными (библиотека масс-спектров NIST 2014 Mass Spectral Search Program Version 2.2).
Для количественного определения тиабендазола использовали УФ-спектрофотометрию, прибор отечественного производства СФ-2000 и кварцевые кюветы (l=1 см).
Результаты и обсуждение
Относительная ошибка среднего результата (n=6; p=0,95) при определении тиабендазола в субстанции равна 1,54% применительно к методу УФ-спетрофотометрии.
Результаты сравнительного изучения изолирования тиабендазола из биологического материала 16 различными изолирующими жидкостями представлены на рис. 1.
Рис. 1. Результаты сравнительного изолирования тиабендазола из биологического материала.
Наибольшая степень извлечения тиабендазола достигается в случае изолирования аналита из модельных смесей ацетоном. Оптимальное извлечение определяемого вещества из трупной печени достигается двукратным изолированием ацетоном по 30 мин при условии превышения массы изолирующего агента над биоматериалом минимум в 2 раза (табл. 1).
Таблица 1. Зависимость степени извлечения (R, %) тиабендазола из биоматериала ацетоном от количественного соотношения биоматериала и изолирующего агента и от кратности настаивания (n=5)
| Взято тиабендазола, мг | Масса ацетона, г | Кратность настаивания | Найдено тиабендазола | |
| мг | % | |||
| 25 | 25 | 1 | 10,045 | 40,18 |
| 2 | 5,91 | 23,64 | ||
| 1+2 | 15,72 | 62,88 | ||
| 3 | 3,38 | 13,52 | ||
| 1+2+3 | 18,865 | 75,46 | ||
| 4 | 2,1825 | 8,73 | ||
| 1+2+3+4 | 20,8125 | 83,25 | ||
| 25 | 50 | 1 | 15,255 | 61,02 |
| 2 | 6,78 | 27,12 | ||
| 1+2 | 21,8 | 87,2 | ||
| 3 | 2,5475 | 10,19 | ||
| 1+2+3 | 24,1125 | 96,45 | ||
| 4 | 1,37 | 5,48 | ||
| 1+2+3+4 | 25,2475 | 100,99 | ||
| 25 | 62,5 | 1 | 15,925 | 63,7 |
| 2 | 6,425 | 25,7 | ||
| 1+2 | 22,115 | 88,46 | ||
| 3 | 2,3925 | 9,57 | ||
| 1+2+3 | 24,2725 | 97,09 | ||
| 4 | 1,0175 | 4,07 | ||
| 1+2+3+4 | 25,055 | 100,22 | ||
| 25 | 75 | 1 | 16,24 | 64,96 |
| 2 | 6,2475 | 24,99 | ||
| 1+2 | 22,2525 | 89,01 | ||
| 3 | 1,6875 | 6,75 | ||
| 1+2+3 | 23,705 | 94,82 | ||
| 4 | 0,95 | 3,8 | ||
| 1+2+3+4 | 24,42 | 97,68 | ||
| 25 | 100 | 1 | 17,14 | 68,56 |
| 2 | 5,445 | 21,78 | ||
| 1+2 | 22,35 | 89,4 | ||
| 3 | 1,475 | 5,9 | ||
| 1+2+3 | 23,59 | 94,36 | ||
| 4 | 0,5725 | 2,29 | ||
| 1+2+3+4 | 23,9275 | 95,71 | ||
Очистку извлечения целесообразно проводить колоночной хроматографией обычного давления с применением подвижной фазы ацетон-дихлорметан (9,5:0,5). Анализируемое вещество обнаруживается во фракциях №7—13 (13—24 мл).
Провели контрольные опыты по определению фонового поглощения ацетонитрильного раствора сухого остатка извлечений из ткани печени, не содержащей определяемого вещества. Оно не превысило 0,07 при длине волны 301 нм.
Результаты изучения хроматографического поведения тиабендазола в присутствии некоторых структурно похожих веществ методом тонкослойной хроматографии представлены в табл. 2.
Таблица 2. Результаты хроматографирования тиабендазола и близких по структуре соединений в тонком слое гидроксилированного сорбента (пластины «Сорбфил» ПТСХ-АФ-А-УФ)
| Подвижная фаза | Мебендазол | Альбендазол | Тиабендазол | Дибазол | Фундазол | |||||
| Rf | Rs | Rf | Rs | Rf | Rs | Rf | Rs | Rf | Rs | |
| Гексапропанол-2 (2:8) | 0,70 | 0,86 | 0,64 | 0,79 | 0,58 | 0,71 | 0,81 | 1,00 | 0,94 | 1,16 |
| Дихлорметан-пропанол-2 (2:8) | 0,74 | 0,92 | 0,66 | 0,82 | 0,60 | 0,73 | 0,81 | 1,00 | 0,87 | 1,07 |
| Толуол-пропанол-2 (8:2) | 0,73 | 1,10 | 0,51 | 0,77 | 0,45 | 0,69 | 0,66 | 1,00 | 0,82 | 1,25 |
| Гексан-этилацетат (2:8) | 0,61 | 1,23 | 0,27 | 0,54 | 0,31 | 0,63 | 0,50 | 1,00 | 0,93 | 1,86 |
| Дихлорметан-ацетон (8:2) | 0,58 | 0,98 | 0,45 | 0,76 | 0,26 | 0,44 | 0,59 | 1,00 | 0,94 | 1,59 |
| Толуол-ацетон (5:5) | 0,66 | 1,08 | 0,56 | 0,92 | 0,45 | 0,74 | 0,61 | 1,00 | 0,93 | 1,51 |
| Толуол-ацетон (8:2) | 0,58 | 1,57 | 0,43 | 1,18 | 0,29 | 0,79 | 0,37 | 1,00 | 0,95 | 2,57 |
| Толуол-ацетонитрил (2:8) | 0,69 | 0,92 | 0,60 | 0,81 | 0,53 | 0,71 | 0,74 | 1,00 | 0,91 | 1,23 |
| Толуол-ацетонитрил (8:2) | 0,41 | 1,65 | 0,26 | 1,06 | 0,20 | 0,82 | 0,25 | 1,00 | 0,93 | 3,77 |
| Гексан-лиоксан-метановая кислота (25:15:1) | 0,51 | 0,98 | 0,61 | 1,15 | 0,16 | 0,30 | 0,53 | 1,00 | 0,95 | 1,80 |
Проанализировав данные таблицы, можно рекомендовать оптимальные подвижные фазы для нормальнофазовой тонкослойной хроматографии: толуол-пропанол-2 (8:2), толуол-ацетон (8:2), толуол-ацетонитрил (2:8). Для последующих исследований из указанных подвижных фаз выбрали смесь толуол-ацетонитрил (2:8).
Для идентификации аналита методом ГХ-МС предложено хроматографирование в капиллярной колонке НР-5MS диаметром 0,25 мм и длиной 30 м с неполярной неподвижной фазой (5%-фенил)-метилполисилоксан толщиной 0,25 мкм. Температурная программа термостата колонки: начальная температура колонки 100 °C с изотермической выдержкой в течение 1 мин, с последующим температурным градиентом 35 °C/мин до 300 °C с изотермической выдержкой при конечной температуре 15 мин. Температура испарителя хроматографа 270 °C, устройства сопряжения с детектором (аналитический интерфейс хроматограф/масс-спектрометр) 280 °C, квадруполя 150 °C, источника ионов 230 °C. Пробу вводят в режиме без деления потока. Масс-спектры регистрируют по полному ионному току после задержки на выходе пика растворителя через 3 мин после ввода пробы. Время анализа — 16,7 мин.
Спектр поглощения электромагнитного излучения тиабендазола в среде ацетонитрила в диапазоне длины волны 245—380 нм имеет две точки экстремумов (λmax) — при 229 и 301 нм. При построении градуировочного графика для количественной оценки аналита определяли оптические плотности градуировочных растворов в точке максимума при длине волны 301 нм. Уравнение имело следующий вид:
A=0,101281·C–0,009396,
где A — оптическая плотность; C — содержание анализируемого вещества в фотометрируемом растворе (мкг/мл).
График линеен в интервале концентраций 0,4—15,0 мкг/мл. Коэффициент корреляции более 0,999.
Минимальная обнаруживаемая концентрация тиабендазола 2,0·10–7 г в 1 мл фотометрируемого раствора.
Предлагаемая схема исследования биологического материала
Изолирование. 25 г биологического объекта, содержащего тиабендазол, настаивали дважды по 0,5 ч порциями ацетона массой 50 г (62,5 мл) каждая; смесь периодически перемешивали. Объединенные извлечения пропускали через слой натрия сульфата безводного 1,5—2,0 см, предварительно промытого 20 мл ацетона. Из объединенных фильтратов упаривали растворитель при комнатной температуре. Остаток сухого вещества растворяли в 2 мл смеси ацетон-дихлорметан (9,5:0,5) и вводили полученный раствор в колонку, заполненную 10 г силикагеля типа L 40/100 мкм, для проведения очистки методом хроматографии низкого давления. Хроматографировали смесью ацетон-дихлорметан (9,5:0,5). Элюат собирали по 2 мл фракциями. Фракции с №7 по №13 включительно объединяли, испаряли в токе воздуха при комнатной температуре. Остаток сухого вещества растворяли в 10 мл ацетона, после чего в три выпарительные чашки (№1, №2 и №3) вносили соответственно 0,1—2,5 мл, 4,0 мл и 0,1—2,5 мл ацетонового раствора и испаряли растворитель.
Идентификация методом ТСХ. Остаток №1 растворяли в минимально необходимом объеме (0,4—0,6 мл) ацетона и количественно наносили на линию старта хроматографической пластины «Сорбфил» ПТСХ-АФ-А-УФ (подвижная фаза — толуол-ацетонитрил 2:8) для детектирования тиабендазола в УФ-лучах, используя вещество-свидетель. Идентифицировали определяемое вещество по величине Rf, совпадающей с таковой вещества-свидетеля (0,53±0,03).
Идентификация методом УФ-спектрофотометрии. После хроматографирования вещества в тонком слое нормальнофазавого сорбента пятно тиабендазола вырезали и помещали в пробирку, элюирование проводили 5 мл ацетонитрила 15 мин и исследовали электромагнитное поглощение в дапазоне длин волн 245—320 нм. Идентификацию проводили по форме спектральной кривой и положению точек экстремумов (229±1 и 301±2 нм) (рис. 2).
Рис. 2. УФ-спектры ацетонитрильных растворов тиабендазола.
1 — извлеченного из крови; 2 — стандартного вещества (0,0005% раствор); 3 — извлеченного из печени.
Идентификация методом хромато-масс-спектрометрии. Остаток в чашке №2 растворяли в этилацетате и исследовали хроматографическую подвижность с масс-селективным детектированием по приведенной ранее схеме (рис. 3).
Рис. 3. Газожидкостная хроматограмма и масс-спектр тиабендазола.
Количественное определение. Оценку количественного содержания определяемого соединения осуществляли методом спектрофотометрии по интенсивности электромагнитного поглощения при длине волны 301 нм с использованием градуировочного графика и учитывая массу навески тиабендазола в модельной смеси (табл. 3).
Таблица 3. Результаты количественного определения тиабендазола в модельных смесях с биологическими объектами
| Биологический объект | Внесено тиабендазола (мг в 25 г биологического объекта) | Найдено тиабендазола, % (n=5; P=0,95) | ||||
| x | S | Sr | Sx | Dx | ||
| Ткань печени | 1,25 | 85,05 | 2,89 | 0,034 | 1,29 | 3,59 |
| 2,5 | 86,33 | 2,34 | 0,027 | 1,05 | 2,91 | |
| 10,0 | 86,54 | 1,88 | 0,021 | 0,84 | 2,35 | |
| 25,0 | 87,20 | 1,71 | 0,019 | 0,76 | 2,12 | |
| 50,0 | 88,18 | 1,56 | 0,017 | 0,70 | 1,94 | |
| Кровь | 1,25 | 87,09 | 2,45 | 0,028 | 1,10 | 3,05 |
| 2,5 | 88,14 | 2,15 | 0,025 | 0,96 | 2,68 | |
| 10,0 | 89,68 | 1,82 | 0,021 | 0,81 | 2,26 | |
| 25,0 | 90,64 | 1,65 | 0,019 | 0,74 | 2,04 | |
| 50,0 | 91,78 | 1,49 | 0,017 | 0,67 | 1,86 | |
Как видно из полученных результатов, разработанные методики характеризуются достаточно высокой степенью извлечения тиабендазола из ткани печени (85,05—88,18%) и крови (87,09—91,78%) при концентрации анализируемого вещества в биоматериале 0,005—0,2%.
Провели валидацию предлагаемых методик. Найденные пределы обнаружения тиабендазола в печени и крови составляют соответственно 0,14 и 0,10 мг, пределы количественного определения — 0,26 и 0,18 мг в 100 г биологического объекта. Разработанные методики удовлетворяют валидационным критериям линейности, селективности, правильности и прецизионности, принятым в отношении биоаналитических методик.
Выводы
1. Обоснована возможность и определены оптимальные условия изолирования тиабендазола из биологического материала ацетоном: двукратное по 30 мин настаивание при массовом отношении изолирующей жидкости и биоматрицы 2:1.
2. Для очистки извлекаемого из биоматриц аналита предложена хроматография в полупрепаративной колонке силикагеля L 40/100 мкм, для идентификации и количественного определения — методы ТСХ, ГХ-МС и УФ-спектрометрии.
3. Разработаны методики определения тиабендазола в биоматрицах. При содержании аналита в биоматериале 0,005—0,2% они обеспечивают определение аналита в ткани печени и крови на уровне соответственно 85,05—88,18% и 87,09—91,78%.
4. Разработанные методики удовлетворяют критериям необходимой линейности, селективности, правильности и прецизионности.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.