В последние годы появление новых психоактивных веществ (ПАВ) на рынке запрещенных препаратов притягивает особое внимание научных и криминалистических сообществ всего мира. ПАВ является обобщающим понятием для синтетических соединений, имитирующих психотропные эффекты уже известных наркотических средств (НС) [1, 2]. Такие соединения обычно обладают минорными структурными модификациями, преимущественно воздействуя на опиоидные или каннабиноидные рецепторы аналогично уже известным запрещенным веществам. По этой причине до включения в список контролируемых НС и ПАВ они могут безнаказанно распространяться по всему миру [3, 4].

На сегодняшний день под особым контролем Европейского центра по мониторингу распространения наркотиков и наркотической зависимости (EMCDDA) более 800 ПАВ, а случаи их изъятия установлены в 110 странах по всему миру [5].

На черном рынке запрещенных препаратов ПАВ обычно распространяются со следующей маркировкой: «соли для ванн», «удобрения», «реактивы только для научного использования». Вследствие отсутствия необходимой информации об их взаимодействии с другими наркотическими препаратами, а также наличия возможных примесей и различной дозировки возникают риски при оценке и расчете необходимой для употребления дозы. Помимо этого ПАВ обладают высокой аффинностью связывания с рецепторами по сравнению с классическими веществами натурального происхождения, что усиливает их активность и достаточно часто повышает риск возникновения нежелательных побочных эффектов. Все это способствует увеличению числа тяжелых интоксикаций, вызванных употреблением ПАВ, нередко сопровождающихся обращением в скорую неотложную помощь, а в ряде случаев заканчивающихся летальным исходом [6, 7].

Ежегодно увеличивается число новых ПАВ в незаконном обороте, а также количество зафиксированных случаев передозировок. На сегодняшний день не существует быстрых и комплексных методик скрининга ПАВ в биологических образцах [8]. Появление новых производных ПАВ, а также широкое разнообразие физико-химических свойств каждого отдельного вещества данной группы НС затрудняют их обнаружение в биологических образцах при судебных и клинико-токсикологических экспертизах [9]. Для их идентификации в биологических матрицах необходима разработка быстрых, селективных и чувствительных подходов. Аналитические методы, рутинно используемые в химико-токсикологических лабораториях, направлены преимущественно на идентификацию уже известных соединений, особенно иммуноферментные анализы, что приводит к большому числу ложноположительных результатов [10,11].

Цель данной работы — создание быстрой первичной скрининговой методики определения ПАВ и их метаболитов в моче методом ВЭЖХ-МС/МС.

Материал и методы

Реагенты

Для приготовления подвижных фаз, буферных и рабочих растворов использовали деионизованную воду (удельное сопротивление 18,2 мОм/см), полученную с помощью установки Milli-Q Integral-5 («Millipore», Франция), и органические растворители: ацетонитрил марки «для хроматографии» HPLC 99,8% («Baker», Германия), муравьиную кислоту марки «mass spectrometry grade >98%» («Fluka», Швейцария), формиат аммония («ACROS ORGANICS», Германия), метанол марки «LC-MS grade» («Merck», Германия). Работоспособность системы ВЭЖХ-МС проверяли с помощью тестовой смеси веществ («Waters Corporation», США), а также раствора резерпина (концентрация 5 нг/мл). При настройке масс-спектрометра применяли рекомендованные производителем калибраторы.

Условия пробоподготовки биологических образцов

Для выполнения скрининговой процедуры определения ПАВ и их метаболитов в моче в конусообразный фалькон Эппендорф вместимостью 1,5 мл помещали 100 мкл мочи и добавляли 150 мкл смеси ацетонитрил:вода (70:30). Далее смесь перемешивали на вортексе в течение 15 с и центрифугировали 5 мин при 15 000 об./мин. Затем отбирали 40 мкл супернатанта и добавляли 60 мкл воды, перемешивали на вортексе в течение 10 с и переносили в виалу для последующего анализа ВЭЖХ-МС/МС.

Условия ВЭЖХ-МС/МС инструментального анализа

Анализ проводили с использованием системы хроматограф — трехквадрупольный масс-спектрометр ACQUITY Xevo TQ-S micro IVD («Waters Corporation», США). В качестве элюентов использовали 0,1% раствор муравьиной кислоты, содержащий 2 мМ формиата аммония и 1% ацетонитрила (фаза А), и раствор ацетонитрила с 0,1% муравьиной кислотой, 2 мМ формиата аммония и 1% деионизированной воды (фаза В). Градиентное элюирование на аналитической колонке проводили по следующей программе: 0—1 мин — 10% В; 7,5—11,5 мин — 90% В; 11,75 мин — 10% В; 14 мин — 10%. Устанавливали следующие условия масс-спектрометрического детектирования: температура внутреннего капилляра 250 °C, напряжение на эмиттере 2 кВ, напряжение на конусе 25 В, температура десольватации 600 °С, скорость потока газа в источнике 1000 л/ч. Детектирование аналитов проводили в режиме мониторинга выбранных реакций (МВР). Условия масс-спектрометрического определения (напряжение на капилляре и энергия коллизии) для каждого соединения подбирали с помощью программного обеспечения MassLynx в условиях положительной и отрицательной электроспрей ионизации (ЭСИ).

Условия подтверждающей методики с использованием масс-спектрометрии высокого разрешения (ВЭЖХ-МС-QTOF)

Подтверждающий анализ выполняли на системе ВЭЖХ-QTOF-МС/МС,состоящей из жидкостного хроматографа Elute UHPLC («Bruker Daltonik GmbH», Германия) в сочетании с квадруполь-времяпролетным масс-спектрометром высокого разрешения (UHR-QTOF) maXis impact («Bruker Daltonik GmbH», Германия). Хроматографическое разделение аналитов проводили на колонке Intensity Solo C18-2 (100×2,1 мм; 1,8 мкм) c предколонкой ACQUITY UPLC BEH C18 (5×2,1 мм; 1,7 мкм). Температуру термостата колонки устанавливали 40 °C, автосамплера 4 °C. Подвижная фаза А (элюент А) состояла из 1% метанола в воде с добавкой 5 мМ формиата аммония (NH₄COОН) и 0,01% муравьиной кислоты. Подвижная фаза В (элюент В) состояла из метанола с добавкой 5 мМ формиата аммония (NH₄COОН) и 0,01% муравьиной кислоты. Скорость потока элюента программировали в диапазоне 0,2—0,5 мл/мин. Градиентное элюирование проводили исходной смесью 96% элюента A и 4% элюента B с изократической выдержкой в течение 1 мин. Затем содержание элюента В увеличивали до 50% и далее до 99,9%. В течение последних 4 мин анализа содержание элюента B снижали до 4% с выдержкой 3 мин. Для ионизации использовали источник электрораспыления в режиме регистрации положительных ионов. Параметры источника ионов: напряжение на капилляре 4500В; температура N₂ (осушающий газ) 220 °С; скорость потока 8 л/мин. Диапазон регистрируемых масс 30—1000 m/z. Сбор данных проводили в режиме AutoMS/MS. Энергия соударений (СЕ) для режима МС/МС варьировалась в диапазоне 15—30 эВ.

Валидация методики

Для контроля надежности результатов обнаружения ПАВ и их метаболитов, полученных по разработанной методике, проводили валидацию. Стандартами считали стандартизированные образцы мочи (предоставлены ООН), содержащие ряд соединений, относящихся к различным группам исследуемых препаратов, в известных концентрациях. При проведении валидации определяли следующие метрологические характеристики: селективность, специфичность, воспроизводимость площадей и времени удерживания целевых соединений, предел обнаружения (для отдельных соединений) и устойчивость.

Результаты и обсуждение

Представленная в данной работе ВЭЖХ-МС/МС скрининговая методика направлена на качественное определение 138 запрещенных препаратов и их активных метаболитов. Во многих случаях ПАВ используют совместно с другими «традиционными наркотиками», например, амфетаминами или марихуаной. В связи с этим задачей данной работы являлась разработка методики, с помощью которой можно обнаружить наиболее распространенные в настоящее время запрещенные препараты.

Представленная методика дает возможность одновременно определить 89 синтетических каннабиноидов, 16 опиоидных анальгетиков, 13 стимуляторов, 5 галлюциногенов, 6 бензодиазепинов и 9 неклассифицированных препаратов за один ЖХ-МС-анализ (табл. 1).

Методика содержит как минимум два МВР-перехода для каждого соединения. Подобранный хроматографический градиент позволял селективно разделять все включенные в методику соединения. Для соединений ПАВ и их метаболитов, лучше ионизирующихся в отрицательной области, в метод были внесены МВР-переходы для отрицательной ЭСИ (табл. 2).

В качестве подтверждающего подхода при создании экспрессной скрининговой методики применили метод масс-спектрометрии высокого разрешения ВЭЖХ-МС-Q-TOF. Для этого провели анализ положительных образцов мочи, ранее подтвержденных на наличие следов ПАВ. По полученным спектрам рассчитали брутто-формулы и сравнили их с теоретическими, а также определили отклонение (ошибку) точной массы определяемого соединения (рис. 1).

Разработанная методика валидирована на 12 веществах, относящихся к различным классам НС. Методику разработали для качественного определения наркотических препаратов. В связи с этим на этапе валидации оценивали следующие параметры: нижний предел определения, селективность, повторяемость (на трех концентрационных уровнях) и относительное стандартное отклонение интенсивности при кратковременном хранении (табл. 3).

Примечание. НПО — нижний предел определения; S_r — относительное стандартное отклонение.

Разработанная методика апробирована на 50 положительных образцах мочи, предоставленных различными химико-токсикологическими лабораториями после проведения многоцентровых сличительных испытаний. Cоединения определяли рутинными методами и с помощью разработанной методики. Все выявленные соединения подтверждены по точной массе с использованием масс-спектрометрии высокого разрешения (таб. 4).

По результатам апробации методики определили, что наиболее часто встречающимся ПАВ в исследованных образцах мочи были AB-CHMINACA, относящийся к синтетическим каннабиноидам, а также α-PVP (синтетический катинон). Следует отметить, что большинство синтетических каннабиноидов не были идентифицированы в нативной форме, а только в виде метаболитов, преимущественно в качестве карбоксильных производных (за счет потери метокси-, амидных или адамантановых групп). Напротив, большинство синтетических катинонов детектированы в нативной форме.

Так, в образце № 13 идентифицировали четыре контролируемых НС, относящихся к различным классам ПАВ: AB-CHMINACA, 5F-AB-PINACA, MDMB(N)-2201, MDMB(N)-Bz-F (рис. 2).

Ежегодное увеличение количества новых ПАВ на черном рынке запрещенных НС, а также малое число исследований их действия на организм создают ряд сложностей при их детектировании привычными аналитическими методами, рутинно используемыми в химико-токсикологических лабораториях. Кроме того, из-за быстрого метаболизма ПАВ выявление нативных структур данной группы НС в биологических жидкостях практически невозможно. В связи с этим возникает необходимость в определении основных маркеров применения ПАВ. За счет повышенного связывания с рецепторами по сравнению с «традиционными наркотиками» данные препараты употребляют в предельно малых количествах, что вызывает необходимость разработки особых, чувствительных методов для их детектирования.

Провели анализ данных литературы о метаболизме основных классов ПАВ, а также особенностях пробоподготовки и инструментального анализа. С учетом полученных результатов разработали методику определения основных классов НС и их метаболитов, включая ПАВ. Результаты апробации подтвердили селективность и чувствительность разработанной методики. По сравнению с рутинно используемыми скрининговыми методиками, включающими предварительную экстракцию образцов, упрощенный способ пробоподготовки менее затратный по времени, однако обладает сравнимой с уже используемыми методами чувствительностью.

Заключение

Разработана, валидирована и апробирована новая быстрая скрининговая методика определения физиологически активных веществ и их метаболитов в моче методом ВЭЖХ и масс-спектрометрии. Проведенное экспериментально-техническое исследование метаболизма новых ПАВ позволило расширить спектр определяемых соединений.

Стало возможным выявить 143 психоактивных соединения и их метаболиты с помощью единой методики. Разработанная методика полностью валидирована в соответствии с требованиями ООН по валидации качественных методов определения наркотических и психотропных веществ. Она отличается высокой чувствительностью, специфичностью, прецизионностью и стабильностью. Методика апробирована на 50 положительных образцах мочи, содержащих целевые соединения, а также на 50 бланковых образцах, тем самым подтверждена надежность и правильность результатов обнаружения исследуемых физиологически активных веществ и их метаболитов в образцах мочи.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.