Сложный химический состав, разнохарактерность и многообразие биологических объектов обусловливают многостадийность химико-токсикологического анализа. Внедрению современных систем физико-химической идентификации в экспертную практику в последнее время посвящено значительное количество работ в нашей стране и за рубежом [1—4]. Широкое распространение получает газовая хроматография (ГХ) с масс-селективным (МС) детектированием благодаря высокой специфичности и чувствительности. Вместе с тем методики предварительной подготовки проб к этапу инструментального исследования, как правило, основаны на жидкостной (ЖЭ) и твердофазной (ТФЭ) экстракции [3—9].

Относительно недавно предложенный метод экстракционного вымораживания (ЭВ) — extractive freezing-out (EF) [10—13] в качестве этапа пробоподготовки находит широкое практическое применение в химико-токсикологических исследованиях [14—16]. Данный способ сочетает экстракцию с вымораживанием. Он основан на низкотемпературном извлечении целевых компонентов, использующем перераспределение химических веществ между жидкой фазой заранее добавленного незамерзающего органического растворителя и образующейся твердой фазой льда во время замораживания пробы [10, 11, 17].

Следует добавить, что сочетание ЭВ с центрифугированием (ЭВЦ) [11, 18] за счет значительного снижения доли экстрагента в экстракционной системе позволяет уже в результате одной процедуры 25—30-кратно концентрировать целевые вещества в получаемом экстракте [18, 19]. ЭВЦ, сохраняя преимущества ЭВ в сравнении с твердофазной и жидкостной экстракцией [18, 19], еще более эффективен при анализе дисперсных проб и улучшает воспроизводимость результатов в отношении количества получаемого экстракта [19]. Необходимо также отметить, что получаемые экстракты практически не содержат воды, поскольку процесс проводят при температуре –28 ˚С, когда растворимость воды, например, в ацетонитриле не более 4% [20]. Следовательно, без осушки экстракты сразу можно про-анализировать с помощью ГХ без ущерба для разделительной колонки. Все это значительно ускоряет исследование и снижает погрешность определения целевых компонентов, в том числе за счет сокращения числа этапов пробоподготовки.

Цель работы — изучение возможности применения ЭВ в сочетании с центрифугированием (ЭВЦ) на этапе предварительной подготовки биопробы для газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС).

Приводим опыт применения ЭВЦ в экспертной практике Бюро судебно-медицинской экспертизы № 2 Мин-здрава Краснодарского края.

Исследовали образцы трупного материала (печень и почки). Применяли ацетонитрил сорта «0» (НПК «Крио-хром», РФ), этилацетат, бутанол-1 и хлороформ марки «чда» (ЗАО «Вектон»).

Анализ экстрактов провели с помощью ГХ-МС на аппаратном комплексе-хроматографе Маэстро (Interlab) с масс-селективным детектором Agilent Technologies 5975 в стандартных условиях энергии ионизации 70 эВ. Использовали разделительную капиллярную колонку HP-5MS длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм и толщиной пленки неподвижной фазы 0,25 мкм. Скорость газа – носителя гелия 1 мл/мин, деление потока 1:20; температура инжектора 300 ˚С, интерфейса 280 ˚С. Нагрев колонки сразу после инжекции от 100 до 290 ˚С со скоростью 10 ˚С/мин.

Извлечение целевых компонентов из биологического материала вели методами ЖЭ [5, 21] и ЭВ в условиях центрифугирования пробы с использованием криоэкстрактора-центрифуги ЭВЦ-1 (ООО «Химбиомед», Сочи, РФ) [11, 16]. Предварительная подготовка биопробы включала кислотный гидролиз 15 г биоматериала c добавлением 10 мл дистиллированной воды и 3,5 мл концентрированной хлористоводородной кислоты в толстостенной стеклянной колбе с притертой пробкой при нагревании на кипящей водяной бане в течение 45 мин [5, 21]. Гидролизат охлаждали до комнатной температуры, фильтровали через складчатый фильтр, который затем дополнительно промывали 2 мл HCl (6N).

Из полученного фильтрата рН менее 3,0 взяли две аликвоты по 3 мл и поместили в делительную воронку. Кислотность первого образца довели 25% раствором аммиака до рН 7,0—9,0, после чего провели ЖЭ 3 мл хлороформ-но-бутанольной смеси состава 9:1 в соответствии с рекомендациями [21]. Полученный экстракт отделили от водной части, после осушки безводным сульфатом натрия и удаления хлороформа сухой остаток растворили в 0,2 мл этил-ацетата. Далее следовал этап ГХ-МС-экстракта.

Второй образец полученной кислотной вытяжки из органа (3 мл) для ЭВЦ поместили в пенициллиновый флакон. Нейтрализовали 25% раствором аммиака до рН 7,0—9,0, добавив 3 мл ацетонитрила, закрыли резиновой пробкой под алюминиевую обкладку. Тщательно перемешав содержимое флакона встряхиванием, пробу поместили в ротор криоэкстрактора [16]. Центрифугировали со скоростью 4000 об/мин (фактор разделения 1650g) при температуре –28 ˚С в течение 20 мин. По окончании ЭВЦ одноразовым шприцем через прокол иглой в резиновой пробке из флакона взяли 1 мл ацетонитрильного экстракта, поместили в виалу, упарили при температуре ниже 50 ˚С до объема 0,2 мл и исследовали методом ГХ-МС.

На рис. 1 и 2 представлены хроматограммы в режиме регистрации полного ионного тока 40—600 m/z экстрактов печени и почки от трупа, полученных по традиционной методике ЖЭ хлороформно-бутанольной смесью при рН 7,0—9,0 [5, 21].

На рис. 3 приведена ГХ-МС-хроматограмма экстракта того же образца почки от трупа, но полученного методом ЭВ в условиях центрифугирования пробы [16]. Режимы хроматографирования и детектирования аналогичны условиям исследования проб в первых двух случаях (см. рис. 1 и

Как видно из сравнения хроматограмм на рис. 1—3, применение ЭВЦ вместо ЖЭ позволило практически полностью устранить интенсивный «химический фон» соэкстрактивных веществ, наблюдаемый в диапазоне времен удерживания 15—26 мин (см. рис. 1, 2). При изолировании токсикантов из такого типа биологических объектов он мог быть обусловлен присутствием большого количества эндогенных веществ белкового, липидного, углеводного характера и пр. [6, 7]. Между тем возможность отделения сахаридов от биологически активных веществ с помощью ЭВЦ продемонстрирована при изучении растительных экстрактов [22]. Было установлено, что в процессе ЭВЦ углеводы остаются в основном в кристаллизующейся водной части пробы. По-видимому, аналогичный эффект наблюдается и при экстракции целевых компонентов из печени и почки, что проявилось в виде снижения фона соэкстрактивных веществ. Подобная тенденция снижения количества соэкстрактивных веществ при переходе от ЖЭ к ЭВЦ отмечена и при извлечении токсикантов из кислотного извлечения, т. е. из исходной вытяжки без подщелачивания аммиаком.

Присутствие большого количества хроматографических максимумов при анализе с помощью ГХ-МС проб, полученных методом ЖЭ, исключило возможность идентификации каких-либо лекарственных и психотропных веществ в исследуемой кислотной вытяжке.

Уменьшение количества соэкстрактивных веществ при ЭВЦ благоприятно отражается на детектировании целевых компонентов, увеличивая параметр «сигнал/шум». В результате устранение мешающего фона эндогенных веществ при использовании ЭВЦ позволило обнаружить в экстракте почки кетамин. Действительно, при более детальном изучении участка хроматограммы, полученной при ГХ-МС-исследовании ЭВЦ-экстракта почки, как видно на рис. 4, наблюдали четко выраженный хроматографический пик с временем удерживания 15,76 мин. По базе данных масс-спектров NIST, SUDMED_NNCN и AMDLIB с высокой степенью достоверности (91% совпадения спектра ионов) это вещество идентифицировано как кетамин. Данный препарат применяют в медицине и ветеринарии для наркоза. Обращает на себя внимание, что рядом с указанным хроматографическим максимумом отсутствуют какие-либо мешающие компоненты пробы. Это существенно снижает погрешность идентификации.

Результаты анализа согласуются, как оказалось, с обстоятельствами смерти погибшего, а также оперативными сведениями, полученными следственными органами. Они свидетельствовали о том, что при жизни погибший принимал наркотические вещества.

Использование на этапе пробоподготовки биопроб ЭВЦ позволяет значительно снизить фон соэкстрактивных веществ, сократить число манипуляций с пробой. Это уменьшает погрешность результатов исследования, повышает надежность ГХ-МС-идентификации и качество судебно-химического анализа. За счет снижения загрязнения МС-детектора существенно улучшаются условия идентификации и увеличивается срок его работы между фазами необходимого технического обслуживания. Кроме того, получаемые методом ЭВЦ экстракты при использовании ацетонитрила практически не содержат воды и дисперсных частиц. В связи с этим не требуется ни осушающих агентов, ни фильтрования пробы, что сокращает время пробоподготовки и сроки экспертизы в целом. Исследование выполняют с минимальным количеством экстрагента и при низких температурах, что существенно снижает летучесть используемых растворителей и улучшает условия труда. В итоге все это позволяет рекомендовать метод ЭВЦ для применения в химико-экспертной работе, в том числе с использованием ГХ-МС.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.