Провели сравнительный анализ образцов препарата «Авастин», изъятых в рамках расследования уголовного дела по поводу причинения вреда здоровью потерпевшим. Пациентам офтальмологической клиники вводили авастин интравитреально — способом, который не обозначен в инструкции по применению препарата. В результате у пациентов наступили негативные последствия для здоровья.

Для установления обстоятельств, имеющих значение для расследования уголовного дела, у следствия возникла необходимость в назначении химической экспертизы образцов препарата. Задачей экспертизы являлось сопоставление химического состава образцов, изъятых в ходе следствия в офтальмологической клинике, с составом оригинального образца препарата «Авастин» той же серии, изъятого на заводе-изготовителе.

Авастин — это торговое наименование субстанции бевацизумаб, противоопухолевого лекарственного средства. Он представляет собой рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело (мАТ), которое селективно связывается и ингибирует биологическую активность фактора роста эндотелия сосудов. Показаниями к применению бевацизумаба являются некоторые формы рака. Согласно инструкции по применению, препарат необходимо вводить капельно внутривенно. Он не предназначен для интравитреального введения.

С препаратом «Авастин» связаны случаи негативного влияния на здоровье пациентов, вызванные в первую очередь фальсификацией препарата. Сообщения о появлении поддельных образцов авастина за рубежом стали появляться в 2012 г. [1]. Препараты бевацизумаба находятся в высоком ценовом сегменте и при этом входят в топ-15 по объему продаж на мировом рынке [2]. В Российской Федерации бевацизумаб включен в перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов (ЛП) для медицинского применения [3]. Это приводит к тому, что, с одной стороны, подделка и продажа фальсифицированных образцов авастина является источником выгодного нелегального обогащения, а с другой — может вызывать негативные последствия для здоровья пациентов.

Случаи нанесения вреда здоровью пациентов связаны с офф-лейбл использованием авастина в офтальмологии. Офф-лейбл — это применение лекарственных средств по показаниям, не утвержденным государственными регулирующими органами и/или не упомянутым в инструкции по применению. В литературе описаны случаи нежелательных явлений (воспалительные заболевания, эндофтальмиты и пр.), наступивших после инъекций препарата в стекловидное тело при глазных болезнях [4—7]. 18 марта 2009 г. опубликовано письмо Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития «О лекарственном средстве Авастин» [8]. В нем сообщалось о зарегистрированных в Канаде случаях тяжелых воспалительных заболеваний глаз у пациентов после интравитреального применения авастина вне зарегистрированных показаний. Тем не менее интравитреальная инъекция авастина продолжает широко применяться в мире как офтальмологическая процедура. На фоне этого компания-производитель, с одной стороны, не занимается продвижением препарата в офтальмологии, а с другой — не предпринимает активных попыток остановить его офф-лейбл использование.

Таким образом, своевременное выявление контрафактных образцов авастина, а также случаев офф-лейбл использования препарата является необходимой и эффективной мерой предотвращения рисков для здоровья пациентов. В настоящее время в России отсутствует широкая практика химико-токсикологического анализа (ХТА) биотехнологических ЛП, к которым относится бевацизумаб. Первичная цель такого анализа — подтверждение факта подлинности активного компонента. Действующие вещества биофармацевтических ЛП представляют собой высокомолекулярные белковые структуры, получаемые биотехнологическим путем. Для характеризации терапевтических протеинов применяется множество различных аналитических методов и подходов. Так, для определения молекулярной массы используют электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии натрия додецилсульфата (СДС) или лаурилсаркозината (САР) либо нативную масс-спектрометрию (МС). С помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) определяют подлинность белков и проводят анализ чистоты. Для получения детальной информации о первичной структуре биополимера широко применяется метод пептидного картирования ВЭЖХ с использованием ультрафиолетового (ВЭЖХ—УФ) или масс-спектрометрического (ВЭЖХ—МС) детектирования [9].

Целью ХТА является также определение качественного и количественного состава вспомогательных веществ для выявления дополнительных компонентов, не установленных нормативной документацией (НД). Такие данные могут иметь значение для определения происхождения поддельной продукции, расследования действий медицинского персонала или изучения условий хранения и/или транспортировки, приведших к ухудшению качества ЛП, и в конечном счете для установления причин, которые привели к негативным последствиям для здоровья пациентов.

В настоящем исследовании образцы авастина подвергали сравнительному анализу на качественный и количественный состав общедоступными методами ХТА.

Цель исследования — установление подлинности образцов, а также изучение возможности проведения манипуляций с оригинальными образцами.

Поступило 5 образцов препарата «Авастин». Все образцы имели четкую маркировку с указанием названия препарата, действующего вещества, концентрации, лекарственной формы, даты производства, серии, срока годности; на всех флаконах на этикетке был логотип фирмы-производителя («Roche»). Флаконы не имели защитных алюминиевых колпачков и пластмассовых крышек, были укупорены каучуковыми пробками. Полученные на экспертизу образцы были одной серии выпуска. В качестве референтного образца для проведения сравнительного исследования использовали оригинальный препарат «Авастин» той же серии, изъятый на заводе-изготовителе.

Образцам, поступившим на экспертизу, присвоили внутрилабораторные номера от № 1 до № 5, референтный образец — № 6.

Относительную плотность содержимого флаконов с препаратом «Авастин» определяли с помощью рефрактометра Atago PAL-10S (фирма «Atago», Япония), а рН растворов — с помощью универсального рН-метра Seven Compact S220, Mettler-Toledo AG (США).

Предварительный тест на присутствие белка в препаратах проводили при добавлении к испытуемому раствору органического растворителя (холодный ацетон) в соотношении раствор—ацетон 1:5. Образование преципитата оценивали как положительный результат. В качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду, в качестве положительного контроля — референтный образец № 6.

Концентрацию белка определяли методом УФ-СФМ с использованием УФ-спектрофотометра NanoDrop ND-1000 при 260/280 нм и молярном коэффициенте экстинкции 243, 340 M^–1cm^–1 для 1 мг/мл. Фильтрат препарата, полученный после фильтрации на 10 кДа центрифужных фильтрах Amicon Ultra 10K («Millipore», США), использовали как отрицательный контроль (бланк).

Для качественного анализа анионов использовали фильтраты, полученные после центрифугирования содержимого исследуемых препаратов на 10 кДа фильтрах Amicon Ultra 10K.

Присутствие хлорид-ионов в образцах определяли при добавлении к исследуемому образцу разбавленной азотной кислоты и нитрата серебра (ГФ XII). Для подтверждения присутствия хлорид-ионов использовали стандартный раствор натрия хлорида, в качестве отрицательного контроля — деионизированную воду.

Присутствие фосфат-ионов в образцах определяли по реакции с нитратом серебра (ГФ XIII, метод А) или с молибдатом аммония (ГФ XIII, метод B). Для определения количественного содержания фосфаты переводили в фосфорно-молибденовую синь, поглощающую излучение в видимой области спектра. Для этого исследуемые образцы разбавляли деионизированной водой в 1000 раз, после чего полученный раствор отфильтровывали через 3 кДа центрифужные фильтры Macrosep Advance 3K («Pall Corporation», CША) для удаления белка. Затем к 500 мкл фильтратов каждой пробы добавляли по 10 мкл сульфомолибденового реактива. Через 5 мин к образцам добавляли по 5 мкл свежеприготовленного раствора олова (II) хлорида и дополнительно выдерживали 10 мин для образования молибденовой сини. Полученные окрашенные растворы подвергали спектрофотометрическому (СФМ) анализу (спектрофотометр Cary 60 UV-Vis фирмы «Agilent Technologies», США) при длине волны излучения 690 нм в кювете с длиной оптического слоя 10 мм. Для приготовления калибровочных стандартов брали образцы гидрофосфата натрия, содержащие известные концентрации фосфат-иона в диапазоне 0,75—10 мкг/мл. Калибровочные кривые получали при анализе двух серий калибраторов, каждая из которых содержала по шесть калибровочных растворов. Каждую серию калибраторов анализировали дважды. Для описания параметров калибровочных функций применяли линейную модель, построенную методом наименьших квадратов (МНК) в координатах: Х — концентрация исследуемого аналита в калибровочном стандарте (мкг/мл), Y — значение оптической плотности раствора аналита. Коэффициент корреляции Пирсона (R2) для калибровочной функции фосфат-иона составил 0,9997.

Протокол ферментативного ги дролиза

Образцы анализировали методом ВЭЖХ—МС/МСВР после их протеолитического расщепления трипсином. Аликвоту исследуемого образца (40 мкл) разбавляли раствором 8M мочевины («GE Healthcare», Швеция) в 50 мМ Tris-HCl («Sigma-Aldrich», США) до теоретического содержания бевацизумаба 1 мг/мл (960 мкл). В пробирки вместимостью 0,5 мл («Eppendorf LoBind», Германия) переносили по 10 мкл полученных растворов, дополнительно добавляли 15 мкл 8M мочевины в 50 мМ Tris-HCl (pH 7,4). Для восстановления дисульфидных связей к каждой пробе добавляли 2,5 мкл 100 мМ раствора 1,4-дитиотреитола (ДТТ, «Sigma-Aldrich», США), тщательно перемешивали и инкубировали при температуре 56 °С в течение 1 ч при постоянном перемешивании на термомиксере («Eppendorf», Германия). После этого восстановленные дисульфиды алкилировали добавлением к каждому образцу 2,5 мкл 200 мМ йодацетамида («Sigma-Aldrich», США), реакционную смесь тщательно перемешивали и выдерживали в темноте при комнатной температуре в течение 45 мин. Затем в образцы повторно добавляли по 2 мкл 100 мМ раствора ДТТ и дополнительно выдерживали в темноте 10 мин при комнатной температуре. После восстановления и алкилирования дисульфидов объем каждой пробы доводили до 100 мкл 50 мМ бикарбонатом аммония (рН 7,8), затем добавляли 200 нг/мкл рабочего раствора трипсина (Sequencing Grade Modified Trypsin; «Promega», США) в соотношении масс трипсин—белок 1:20. Реакционную смесь тщательно перемешивали с помощью вортекса, а затем инкубировали в течение ночи при температуре 37 ºC. Терминирование реакции трипсинолиза проводили путем добавления концентрированной муравьиной кислоты в каждую пробу до конечной концентрации 5%. Образцы переносили в виалы и анализировали методом ВЭЖХ—МС/МСВР.

Параметры ВЭЖХ—МС/МСВР

Анализ триптических гидролизатов исследуемых образцов препарата «Авастин» проводили методом ВЭЖХ—МС/МСВР с использованием гибридного жидкостного хромато-масс-спектрометра LCMS-IT-TOF, оснащенного насосами модели LC-20AD, дегазатором модели DGU-20A5R, автосамплером модели SIL-20ACXR, колоночным термостатом модели CTO-20AC, а также контрольным модулем CBM-20A, совмещенным с масс-спектрометром IT-TOF («Shimadzu Corp», Япония). Разделение триптических пептидов проводили на аналитической колонке Phenomenex Kinetex C18 column (150×2,0 мм; 2,6 μМ) с использованием градиентного элюирования при термостатировании аналитической колонки (37 °С) в следующем режиме: 0 мин — 5% B, 5 мин — 10% B, 15 мин — 40% B, 17 мин — 98% B, 19 мин — 98% B, 19,5 мин — 5% B, 25 мин — 5% B. В качестве водной (А) и органической (B) подвижных фаз использовали 0,1% раствор муравьиной кислоты в воде и 0,1% раствор муравьиной кислоты в ацетонитриле соответственно. Общее время анализа составляло 25 мин, скорость потока подвижных фаз — 0,4 мл/мин. Аналиты ионизировали в источнике электрораспылительной ионизации при следующих условиях: скорость потока распыляющего газа (N₂) 1,5 л/мин, температура линии десольватации 200 °C, температура нагревающего блока 250 °C, напряжение интерфейса и детектора 4,5 и 1,6 кВ соответственно. Спектры МС/МС получали диссоциацией, индуцированной соударениями с инертным газом (аргон), в автоматическом режиме (auto ms2). Ион-прекурсор выбирали в диапазоне 300—1500 m/z, окно изоляции иона-прекурсора — 3 m/z. Время накопления ионов составляло 20 и 50 мс для стадий МС1 и МС/МС соответственно, относительная энергия соударений — 50%, объем анализируемых проб — 3 мкл.

Сбор и обработку полученных данных производили с помощью программного обеспечения LC/MS Solution, версия 3.41. Идентификацию протеотипических пептидов осуществляли посредством обработки масс-спектров ВР с использованием программного обеспечения PEAKS Studio, версия 7.0.

Анализ САР—ПААГ с последующим окрашиванием раствором Кумасси G-250 (Cat # 161−0803, «Bio-Rad», США) выполняли для определения количества препарата в исследованных образцах № 1—5 по сравнению с его содержанием в референтном образце № 6, а также для оценки положения белковых полос бевацизумаба в геле в денатурирующих условиях до и после IdeS-гидролиза и определения их молекулярных масс (мол. м.). Для эксперимента брали 10 мкг каждого исследуемого образца препарата и референтного образца (№ 1—6) в 10 мкл фосфатно-солевого буфера (ФСБ). Для гидролиза в присутствии IdeS к каждому образцу добавляли по 20 Ед протеазы (сток-раствор в воде, 25 Ед/мкл) и инкубировали в термомиксере при температуре 37 °С в течение 1 ч (350 rpm; «Eppendorf», Германия). Затем добавляли по 3,5 мкл 4-кратного загрузочного буферного раствора образца (424 мM Трис гидрохлорид, 564 мM Трис основание, 8% саркозил, 40% глицерин, 2,04 мM ЭДТА и феноловый красный в качестве лидирующего красителя), 0,5 мкл 40-кратного редуцирующего агента 1,4-дитиотреитола и прогревали в термомиксере при температуре 95 °С в течение 5 мин (350 rpm; «Eppendorf», Германия). В качестве электродного буферного раствора использовали МОПС буферный раствор (50 мM МОПС, 50 мM Трис основание, 0,1% саркозил, 1 мM ЭДТА). Далее все образцы вносили в лунки полиакриламидного предзалитого геля 12% Bis-Tris Precast gel формата Criterion (Cat # 345−0118, «Bio-Rad», США) вместе с образцами предокрашенных стандартов мол. м. (7 мкл, Cat # 161−0393, «Bio-Rad», США). Электрофорез проводили при постоянном напряжении (180 В) в течение 60 мин с использованием электрофоретической ячейки формата Criterion (Cat # 165−6001; «Bio-Rad», США). Затем гель промывали 3×5 мин деионизированной водой и инкубировали в растворе Кумасси G-250 в течение 45 мин. Далее гель отмывали 5×10 мин деионизированной водой и визуализировали окрашенные белковые полосы с помощью гель-документирующей системы ChemiDoc™ MP («Bio-Rad», США).

В образцах № 1—5 наблюдали опалесценцию со степенью, не превышающей эталон сравнения III (ГФ XII); интенсивность окраски превышала эталон сравнения В6 (ГФ XII); присутствовали видимые включения. Референтный образец № 6 был прозрачен и бесцветен по сравнению с водой для инъекций, без видимых включений. Измеренный объем содержимого исследуемых образцов № 1—5 отличался от нормы (4 мл), при этом в образце № 3 объем жидкости был завышен более чем на 2 мл.

На начальном этапе исследования образцы подвергли «быстрому» тесту на присутствие белка (метод «осаждения»), после чего определяли физико-химические характеристики содержимого исследуемых флаконов по показателям: рН, плотность, содержание белка. Провели общие реакции на присутствие фосфат-ионов, хлорид-ионов. Результаты экспериментов представлены в табл. 1.

При добавлении органического растворителя к испытуемым образцам во всех случаях наблюдали быстрое образование преципитата. Концентрация белка в образцах № 1—5 была снижена в 1,7—6,2 раза по сравнению с образцом сравнения № 6. Образцы № 1—4 имели значение рН ниже, а образец № 5— выше того же показателя, полученного для образца № 6. Относительная плотность содержимого флаконов № 1—5 была ниже по сравнению с референтным образцом. Уменьшение специфической плотности испытуемых растворов коррелировало со снижением в них количества белка.

В образеце № 6 наблюдали положительную реакцию на фосфат-ионы с раствором серебра нитрата, тогда как в образцах № 1—5 образовывался белый творожистый осадок, не растворимый в 16% разбавленной азотной кислоте и растворимый в 10% растворе аммиака. Образование такого осадка характерно для хлорид-ионов. Чтобы избежать перекрестного влияния хлоридов на обнаружение фосфатов, дополнительно провели реакцию с использованием в качестве открывающего реагента молибдата аммония. Реакция оказалась положительной, однако образование осадков в образцах № 1—5 происходило менее интенсивно по сравнению с референтным образцом. Провели количественную оценку содержания фосфат-ионов в образцах. Анализ показал, что количество фосфатов в образцах № 1—5 значительно ниже, чем в образце № 6, полученном непосредственно от производителя (см. табл. 1).

Исследуемые образцы подвергли электрофоретическому анализу в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях с использованием иммуноглобулиндеградирующего фермента и без него. Результаты эксперимента представлены на рис. 1, см. на цв. вклейке. После анализа методом САР-ПААГ получили следующие значения (в усл.ед.): образец № 1— 201472,5; № 2— 127159,4; № 3— 177814,1; № 4— 278542,9; № 5— 513611,3; № 6— 892999,7.

Бевацизумаб имеет мол. м. около 150 кДа. Образцы № 5 и № 6 содержат большее количество препарата по сравнению с образцами № 1—4, видны интенсивно окрашенные белковые полосы неденатурированного бевацизумаба. В образце № 5 интенсивность окрашивания белковых полос менее выражена относительно референтного образца № 6. В образцах № 1—4 препарат полностью денатурировал. На рис. 1, а четко видны полосы мол. м. около 50 кДа (HC) и 23—25 кДа (LC). В результате расщепления иммуноглобулиндеградирующим ферментом IdeS [10] в восстанавливающих условиях бевацизумаб образует три субъединицы — LC, Fc/2 и Fdʹ фрагменты тяжелой цепи, последние имеют мол. м. около 25 кДа и представлены на рис. 1, б в виде слитых с Fc/2 полос. Полосы тех же фрагментов наблюдаются и в исследуемых образцах № 1—5, однако интенсивность их окрашивания выражена в меньшей степени. Провели оценку интенсивности окраски белковых полос бевацизумаба в образцах № 1—6 с помощью программного обеспечения ImageLab («Bio-Rad», США).

Таким образом, содержание бевацизумаба в образцах № 1—4 в среднем в 5 раз меньше, а в образце № 5 в 1,7 раза меньше, чем в референтном образце № 6.

Бевацизумаб является активным ингредиентом препарата «Авастин» и представляет собой гуманизированное моноклональное IgG1 антитело, которое ингибирует биологическую активность VEGF. Это гликопротеин с мол. м. приблизительно 149 кДа, состоит из двух молекул легкой цепи, содержащей 214 а.к. остатка (C₁₀₃₄H₁₅₉₁N₂₇₃O₃₃₈S₆, мол. м. 23446,71) и двух молекул тяжелой цепи, содержащей 453 а.к. остатка (C₂₂₃₅H₃₄₁₃N₅₈₅O₆₇₈S₁₆, мол. м. 49838,57, включая C-концевой остаток лизина). Бевацизумаб содержит шесть комплементарно определяющих регионов мышиного моноклонального антитела против VEGF, которые включены в каркас антитела человека [11—14].

Для оценки подлинности исследуемых образцов препарата на содержание в них активного ингредиента бевацизумаба использовали метод пептидного картирования с применением ВЭЖХ—МС/МСВР. Для этого аликвоты образцов препарата подвергали гидролитическому расщеплению трипсином. Полученный гидролизат анализировали с помощью ВЭЖХ-МС/МСВР в режиме автоматического сканирования (auto ms2). После ферментативного гидролиза референтного препарата бевацизумаба идентифицировали пептиды различных регионов тяжелой и легкой цепей соответственно. Аминокислотная последовательность каждого обнаруженного пептида была установлена по соотнесению характеристичных фрагментных ионов (b- и y-типа) соответствующих мультизарядных прекурсоров с теоретически рассчитанными значениями (PEAKS Studio; «Bioinfor», США). Покрытие аминокислотной последовательности референтного препарата бевацизумаба составило 92% для тяжелой и 86% для легкой цепи (рис. 2).

Гидролизаты, полученные после трипсинолиза образцов № 1—5, содержали меньшее количество пептидов бевацизумаба, интенсивность сигнала которых заметно ниже по сравнению с референтным образцом. В табл. 2 приведены характеристики триптических пептидов различных регионов тяжелой и легкой цепей белка, включая специфические пептиды комплементарно определяющих регионов, обнаруженные в объектах исследования. Таким образом, уменьшение числа и интенсивности обнаруженных пептидов в образцах № 1—5 связано с более низким содержанием в них активного компонента относительно референтного препарата.

Представлены результаты исследования пяти образцов препарата «Авастин», изъятых из офтальмологической клиники, с помощью различных методов ХТА. Основная задача экспертизы — установить подлинность действующего вещества препарата «Авастин» — бевацизумаба. Кроме того, получили дополнительные аналитические сведения о составе вспомогательных веществ ЛП.

Установили, что все представленные на экспертизу образцы препарата «Авастин» содержат активный компонент. Это подтверждено методом ВЭЖХ—МС/МСВР по наличию в них специфических пептидов легкой и тяжелой цепей бевацизумаба. В исследованных образцах № 1—5 выявили низкое содержание бевацизумаба относительно референтного образца № 6, полученного непосредственно от производителя. В образцах № 1—4 по сравнению с образцом № 6 активного ингредиента оказалось меньше приблизительно в 5 раз, а в образце № 5— в 1,7 раза. Образцы № 1—5 на момент экспертизы были уже вскрыты, поэтому снижение содержания в них активного компонента могло быть вызвано хранением образцов препарата «Авастин» в нестерильных условиях. При электрофоретическом разделении в исследованных образцах детектировались полосы посторонних белков, что может свидетельствовать о частичной деградации активного ингредиента в условиях неправильного хранения или о присутствии в нем посторонних примесей. Посторонние белковые полосы на геле после электрофоретического разделения выражены слабо. Таким образом, значительное снижение содержания бевацизумаба в образцах не обусловлено только его деградацией.

Установленные физико-химические показатели рН и относительная плотность представленных на экспертизу образцов авастина отличаются от тех же показателей референтного препарата. Измеренное с помощью УФ-СФМ количество бевацизумаба в исследованных образцах коррелирует со значением их плотности. В качестве вспомогательных компонентов авастин содержит дигидрат α,α-трегалозы, натрия дигидрофосфата моногидрат, натрия гидрофосфат, а также полисорбат 20. Анализ вспомогательных веществ выявил наличие во всех представленных на экспертизу образцах фосфат-ионов, однако их суммарное содержание в образцах № 1—5 было снижено относительно показателя референтного препарата № 6. Кроме того, те же образцы давали положительную реакцию на хлорид-ионы, которые не являются частью лекарственного средства «Авастин» и не должны присутствовать в подлинном ЛП.

Результаты проведенного исследования позволяют сделать вывод, что представленные на экспертизу образцы содержат активный компонент бевацизумаб. Количественный анализ показал, что в исследованных образцах содержание активного компонента в 1,7—5 раз меньше, чем в референтном образце. Физико-химические характеристики образцов, а также качественный и количественный состав вспомогательных компонентов отличаются от аналогичных показателей в референтном образце. Это указывает на проведение манипуляций с оригинальным препаратом либо его фальсификацию. Использование в медицинских целях изъятых из клинического обращения исследованных образцов могло повлечь за собой неблагоприятные последствия для здоровья пациентов офтальмологической клиники. Рассмотренный случай демонстрирует необходимость разработки быстрых и эффективных стратегий анализа биофармацевтических препаратов в химико-токсикологических лабораториях для принятия своевременных мер по сохранению здоровья пациентов и в превентивных целях.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.