Особенности определения амлодипина в биологическом материале

Амлодипин (2-[(2-аминоэтокси)метил]-4-(2-хлорфенил)-1,4-дигидро-6-метил-3,5-пиридин дикарбоновой кислоты 3-этил 5-метиловый эфир) применяется в лечебной практике в качестве антагониста ионов кальция при стенокардии, ишемической болезни сердца (ИБС) и гипертонической болезни [1, 2].

Это белый кристаллический порошок, температура плавления 199—201 °С, малорастворим в воде (10 мМ), легкорастворим в ДМСО (20 г/л), в этаноле (14 г/л) и метаноле [3—5].

Амлодипин проявляет токсические свойства при попадании в организм человека и теплокровных животных. LD₅₀ амлодипина бесилата для крыс составляет 393мг/кг (самцы) и 686 мг/кг (самки) при пероральном введении, 42 мг/кг — при внутрибрюшинном, 678 мг/кг — при подкожном. Для мышей LD₅₀ данного лекарственного средства при пероральном введении — 37 мг/кг, при внутрибрюшинном — 31 мг/кг, при подкожном — 36 мг/кг. Для собак LD амлодипина бесилата составляет 10 мг/кг. Значения минимальной токсичной дозы (TDLo) при внутривенном введении вещества крысам — 0,1 мг/кг, при пероральном употреблении людьми — 1 или 1,425мг/кг [5, 6].

В научной литературе приводятся данные о многочисленных случаях отравления амлодипином людей, даже с летальным исходом [7—10].

Широкое использование амлодипина для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, его токсические свойства и описанные случаи отравления данным соединением c летальным исходом позволяют считать его потенциальным объектом судебно-химического анализа.

Результаты изолирования амлодипина из биологического (трупный) материала классическими методами показали их низкую эффективность по целому ряду аналитических параметров.

Известны некоторые методики определения амлодипина в жидких матрицах с небольшим содержанием твердого биологического субстрата (плазма крови). В этих методиках изолирующими агентами выступают такие органические жидкости, как этилацетат [11], смесь диэтиловый эфир—гексан (8:2) с использованием карбонатного буфера [12], эфир—гексан (1:1) с использованием карбонатного буфера [13], ацетонитрил [14].

Варианты твердофазной экстракции с применением картриджей Oasis HLB SPE для извлечения амлодипина из плазмы крови и цельной крови трупов [12, 15, 16] не позволяют достичь высокой степени очистки аналита от эндогенных веществ биологического материала. Ряд из них характеризуется относительно невысоким процентом выхода анализируемого соединения из биологических объектов.

Данные об изолировании и очистке амлодипина от соэкстрактивных веществ в основном несистематические и разрозненные. Это свидетельствует о необходимости дальнейшей разработки данных направлений химико-токсикологического анализа амлодипина.

Цель исследования — определение оптимальных условий изолирования амлодипина, его очистки методом колоночной хроматографии и разработка методики определения в биологическом материале.

Объектом исследования служил амлодипин, отвечающий требованиям ФС 42−0214−07 и содержащий 97% и более действующего вещества. Изучали особенности изолирования амлодипина из биологического материала 13 органическими растворителями, водой и водными растворами различной реакции по схемам, описанным для соединений близкой структуры [17, 18].

Готовили модельные смеси амлодипина (размер частиц 5—50 мкм) и мелкоизмельченной (размер частиц 0,2—0,5 мм) ткани печени с содержанием 12,5 мг вещества в 25 г биоматериала, которые выдерживали 1,5 ч при температуре 18—22 °С. Осуществляли 2-кратное (по 30 мин) изолирование амлодипина при соотношении изолирующего агента и биоматериала 2:1 (по массе). Первое и второе извлечения из каждой модельной смеси объединяли, часть такого извлечения хроматографировали на пластинах Сорбфил ПТСХ-АФ-В-УФ (подвижная фаза бутанол—ацетон 5:5 по объему). На хроматограммах в УФ-свете амлодипин обнаруживался в виде темного пятна с Rf 0,51±0,03. Вещество элюировали этанолом 15 мин и идентифицировали по особенностям поглощения элюата в УФ-части спектра. По величине оптической плотности элюата, измеренной при λ=240 нм (спектрофотометр СФ-2000, длина оптического пути 10 мм), определяли количество амлодипина, используя уравнение градуировочного графика.

По наибольшему значению степени извлечения амлодипина из биоматериала выявляли оптимальный изолирующий агент. С помощью описанной ранее схемы изолирования, очистки и определения амлодипина исследовали зависимость величины степени его извлечения из биоматериала оптимальным изолирующим агентом от продолжительности контакта изолирующей жидкости с биоматериалом, кратности настаивания и количественного соотношения изолирующего агента и биологической ткани.

При моделировании условий очистки амлодипина от соэкстрактивных веществ биологических матриц методом обращенно-фазовой колоночной хроматографии выявляли особенности его хроматографического поведения в колонке сорбента Силасорб С-18 30 мкм размером 150×10 мм. Использовали подвижную фазу ацетон—вода (8:2). Элюаты собирали фракциями по 2 мл каждая. Амлодипин обнаруживали во фракциях методом ТСХ (пластины Сорбфил ПТСХ-АФ-В-УФ, подвижная фаза бутанол—ацетон 5:5, объем фракции, наносимый на пластину, 5—10 мкл).

Определяли потери амлодипина при хроматографировании его в колонке обращенно-фазового сорбента.

В контрольных опытах (n=5) при λ=250 нм измеряли фоновое поглощение подвижной фазы для ВЭЖХ, обусловленное соэкстрактивными веществами фракций элюата, в которых возможно присутствие аналита.

Для предварительной идентификации амлодипина изучили возможность применения нормальнофазной ТСХ. Вещество хроматографировали на пластинах Сорбфил ПТСХ-АФ-В-УФ в подвижной фазе бутанол—ацетон 5:5. Для подтверждающей идентификации и количественного определения амлодипина рассмотрена возможность применения хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС) и ВЭЖХ.

При определении амлодипина методом ГХ-МС использовали газовый хроматограф фирмы «Agilent Technologies» (США) модели 6890N с масс-селективным квадрупольным детектором модели 5973N (фирма «Agilent Technologies») и колонку DB-1MS (фирма «J&W Scientific», США) с неподвижной жидкой фазой диметилполисилоксан (длина колонки 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки фазы 0,25 мкм). Масс-селективный детектор работал в режиме электронного удара (70 эВ). Вещество обнаруживали в режиме регистрации по полному ионному току (диапазон сканирования 40—550 m/z).

Исследования методом ВЭЖХ проводили на жидкостном хроматографе Agilent 1100 с УФ-детектором в колонке Hibar размером 150×4,6 мм с сорбентом Purospher STAR RP-18 endcapped 5 мкм.

Результаты сравнительного изолирования амлодипина из ткани печени различными растворителями представлены на рис. 1. Наибольшая степень извлечения достигается при использовании в качестве изолирующего агента ацетона.

В дальнейшем установили, что оптимальными условиями извлечения амлодипина ацетоном из ткани печени являются как минимум двукратное настаивание биоматериала с изолирующим агентом, количественное соотношение ацетон-биоматериал 2:1 или более и продолжительность каждого настаивания не менее 30 мин.

В результате изучения хроматографического поведения амлодипина в колонке обращенно-фазового сорбента Силасорб С-18 выявили, что оптимальной подвижной фазой для элюирования аналита в данных условиях является смесь растворителей ацетон—вода 8:2. В этих случаях обеспечивается достаточно компактный выход вещества из колонки во фракциях элюата № 9—11 (17—22 мл). Потери хроматографируемого аналита при воспроизведении условий очистки не превышают 1,5%.

Фоновое поглощение при λ=250 нм подвижной фазы ацетонитрил-фосфатный буферный раствор рН 9,0 5:5 (10 мл), обусловленное соэкстрактивными веществами из фракций элюата, в которых возможно присутствие аналита, составляет 0,024 (пересчет на 5 г биоматериала).

Методом ГХ-МС определяли амлодипин при температуре инжектора 280 °C, интерфейса детектора — 300 °C. Пробу вводили без деления потока. Начальную температуру термостата колонки (80 °С) поддерживали в течение 1 мин, затем повышали до 250 °C со скоростью 40 °С/мин, затем до 300 °C со скоростью 12,5 °С/мин. В качестве подвижной фазы использовали гелий, который подавали со скоростью 39 см³/мин. Время при конечной температуре 6 мин. Масс-селективный детектор работал в режиме электронного удара (70 эВ). Диапазон сканирования 40—500 m/z. Анализируемое соединение идентифицировали по характерному времени удерживания, а также по совпадению масс-спектра с библиотечным (библиотека Wiley-7nl) на 86% и более.

В масс-спектре амлодипина, полученном в предложенных условиях, наблюдали серию характерных для молекулы аналита осколков (заряженные частицы) с 44, 77, 120, 148, 165, 208, 236, 254, и 297, 347, 377 m/z; основной ион 297 m/z.

Идентификация амлодипина методом ГХ-МС возможна с высокой степенью селективности по времени удерживания вещества в капиллярной колонке и набору сигналов характерных осколков в его масс-спектре. Минимальное открываемое количество амлодипина в данном случае 0,2·10^–9 г в хроматографируемой пробе.

Для определения методом ВЭЖХ в качестве подвижной фазы предложена смесь ацетонитрил-фосфатный буферный раствор с рН 9,0 5:5 по объему. Температура термостата колонки составляла 20 °C, скорость подвижной фазы 1 мл в мин. Оптическую плотность элюата измеряли при λ=250 нм.

Изолирование. 25 г биологического объекта, содержащего амлодипин, настаивали 2 раза по 30 мин с порциями ацетона 50 г каждая при перемешивании, затем извлечения объединяли. Объединенное извлечение пропускали через стеклянный фильтр диаметром 4 см со слоем безводного натрия сульфата толщиной 1,5–2,0 см, слой натрия сульфата промывали 20 мл изолирующего агента. Фильтраты объединяли, растворитель из объединенного фильтрата испаряли при комнатной температуре.

Очистка колоночной хроматографией. Остаток, полученный после испарения растворителя из объединенного фильтрата, растворяли в 4 мл ацетона, доводили до 5 мл водой и 2 мл полученного раствора вводили в колонку сорбента Силасорб С-18 30 мкм размером 150×10 мм. Хроматографировали, используя элюент ацетон—вода 8:2. Элюат собирали фракциями по 2 мл. Фракции 9—11 объединяли, испаряли в токе воздуха при температуре 20—22 °С. Остаток растворяли в 10 мл ацетона (исходный ацетоновый раствор). В три выпарительные чашки (№ 1, № 2 и № 3) вносили соответственно 0,1—2,0, 1,0—2,5 и 5 мл исходного ацетонового раствора и испаряли растворитель.

Идентификация методом ТСХ. Остаток в чашке № 1 растворяли в незначительном объеме ацетона и количественно наносили на линию старта хроматографической пластины Сорбфил ПТСХ-АФ-В-УФ. Хроматографировали, применяя систему бутанол—ацетон в соотношении 5:5 в присутствии вещества-свидетеля. Хроматограммы детектировали в УФ-свете и идентифицировали анализируемое вещество по величине Rf, совпадающей с таковой вещества-свидетеля (0,51±0,03).

Идентификация методом ГХ-МС. Остаток в чашке № 2 растворяли в 4 мл хлороформа. Затем 2 мкл полученного раствора вводили в хроматограф Agilent Technologies (США) модели 6890N с масс-селективным квадрупольным детектором модели 5973N («Agilent Technologies») и хроматографировали в описанных ранее условиях.

Амлодипин идентифицировали по сочетанию времени удерживания вещества в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре (рис. 2,

Как свидетельствуют полученные данные, обнаруживается совпадение масс-спектров анализируемого и стандартного веществ не менее чем на 86%.

Идентификация и количественное определение методом ВЭЖХ. Остаток в чашке № 3 растворяли в 5 мл ацетонитрила, переносили в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводили содержимое колбы фосфатным буферным рН 9,0 раствором до метки. Затем 4 мкл полученного раствора вводили в хроматограф. Хроматографировали, используя подвижную фазу ацетонитрил-фосфатный буфер рН 9,0 5:5 по описанной ранее схеме. Хроматограммы стандарта амлодипина и амлодипина, выделенного из биоматериала и прошедшего стадию очистки, представлены на рис. 4.

Идентификацию амлодипина осуществляли по значению времени его удерживания в аналитической колонке. Обнаруживали совпадение времени удерживания анализируемого вещества методом ВЭЖХ с соответствующим параметром вещества-стандарта.

Оценку количественного содержания проводили с учетом площади хроматографического пика, используя уравнение градуировочного графика.

Валидацию разработанной методики проводили по параметрам линейности, селективности, правильности, прецизионности, пределов обнаружения и количественного определения, а также стабильности в соответствии с международными правилами по валидации биоаналитических методик [19, 20].

Линейность. Градуировочный график, отражающий линейную зависимость площади хроматографического пика (S, усл. ед.) от содержания анализируемого вещества в пробе (С, мкг/г), для определения амлодипина методом ВЭЖХ в биологическом материале (ткань печени) описывают уравнением: S=4,627305∙C–0,252737; коэффициент корреляции r=0,99847.

Отклонения найденных концентраций градуировочных смесей с тканью печени от истинного содержания в них амлодипина представлены в табл. 1.

Селективность. Исследовали по 6 чистых образцов биоматериала и по 6 образцов биоматериала, в каждый из которых добавляли стандарт амлодипина в концентрации 1,2∙10^–5—3,2∙10^–4 г/г. На хроматограммах образцов чистой ткани печени не наблюдалось пиков со значениями времени удерживания, совпадающих со временем удерживания аналита или близких к этому значению.

Правильность и прецизионность. Анализировали по 3 образца биоматериала, в которые вводили стандарт анализируемого соединения для создания концентраций, соответствующих нижнему уровню (3 ПКО), верхнему уровню (80% от верхнего предела рабочего диапазона методики) и среднему уровню (середина между верхним и нижним уровнями концентраций аналита).

Каждый полученный раствор подвергали хроматографированию 5 раз. Исследование осуществляли в течение 1-го и последующего дня. Для найденных значений концентраций рассчитывали значения относительной погрешности (ε, %), стандартного отклонения (S), относительного стандартного отклонения (S_r, %) и ряд других метрологических характеристик (табл. 2).

Предел обнаружения аналита в 1 г биоматериала составляет 0,25∙10^–6 г.

Предел количественного определения в 1 г биоматериала — 4,0∙10^–6 г.

Стабильность. Определяли площади пика анализируемого вещества при хроматографировании его стандартного раствора, сохраняющегося в течение 2 нед при температуре 2—4 °С. Кратковременную стабильность подготовленных проб, сохраняющихся 24 ч, доказывали, определяя площади пиков через 1сут. Определение проводили на уровнях концентраций амлодипина, соответствующих начальной и конечной концентрации участка линейной зависимости. Изменение площадей пиков во всех случаях не превышало 10%.

1. Оптимальные условия извлечения амлодипина из биоматериала достигаются при двукратном настаивании ацетоном, если масса изолирующего агента как минимум превышает массу биологического объекта в 2 раза, а продолжительность каждого настаивания составляет не менее 30 мин.

2. Предложена очистка амлодипина, извлекаемого из биоматрицы, в колонке сорбента Силасорб С-18 30 мкм. Потери аналита при этом не превышают 1,5%. Фоновое поглощение, обусловленное соэкстрактивными веществами (0,5 г в 1 мл подвижной фазы), составляет 0,024.

3. Для идентификации и оценки количественного содержания исследуемого вещества в биологических объектах предложены методы ТСХ, ГХ-МС и ВЭЖХ.

4. Разработана методика определения амлодипина в тканях трупных органов и проведена валидация по критериям линейности, селективности, правильности, прецизионности, стабильности, пределам обнаружения и количественного определения.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.