2,4-Ди-трет-бутилгидроксибензол, он же агидол-10 (в дальнейшем 2,4-ДТБГОБ), представляет собой прозрачные кристаллы от светло- до темно-желтого цвета. Температура кипения 265 °C, плавления — 53—56 °C, практически нерастворим в воде (растворимость составляет 0,033 г/л при температуре 25 °C), хорошо растворим в этаноле, ацетоне, толуоле, алканах и других органических растворителях [1, 2].

2,4-ДТБГОБ получают путем промышленного синтеза, он также продуцируется некоторыми растениями и микроорганизмами. Выделенный из биологических организмов в виде экстрактов, 2,4-ДТБГОБ изучается как ингибитор роста сорняков и средство для борьбы с патогенными грибами [3, 4].

Рассматриваемое соединение применяется при производстве пластификаторов, стабилизаторов, антиоксидантов для авиационного топлива, смол на синтетической основе, пестицидов [5]. 2,4-ДТБГОБ используется как промежуточный продукт для получения стабилизаторов (Irgafos-168, Ethaphos-326, агидол-22, крафанил-У и др.) [6, 7].

2,6-Ди-трет-бутилгидроксибензол (синонимы и торговые названия: 2,6-DTBP, Ethyl 701, Irganox L 140) [8], в дальнейшем 2,6-ДТБГОБ — белое, с желтоватым оттенком кристаллическое вещество, растворимость которого в воде составляет 4,11∙10^–3 г/л.

Данное вещество растворяется в ацетоне, этаноле, ацетонитриле, этилацетате, хлороформе, бензоле, гексане и многих других органических растворителях; плавится при температуре 36—37 °C, кипит при температуре 253 °C [9].

2,6-ДТБГОБ используется в качестве антиокислителя для технических масел, авиационного топлива, полимеров, а также как исходный или промежуточный продукт в синтезе некоторых органических веществ, в частности фармакологически активных соединений [10, 11].

Описана способность 2,6-ДТБГОБ разлагаться под воздействием бактериального штамма Alcaligenes F-3−4 [12].

2,4-ДТБГОБ, 2,6-ДТБГОБ, как и многие другие алкилфенолы, обладают токсическими свойствами для многих видов теплокровных организмов и человека.

LD₅₀ 2,6-ДТБГОБ для крыс при пероральном способе поступления — 1320 мг/кг, при внутривенном — 120 мг/кг [13]. По величине LD₅₀ при пероральном введении вещество относится к III классу опасности (умеренно опасные вещества).

В источниках литературы имеются данные об отравлениях гидроксиаренами, к которым относятся 2,4-ДТБГОБ и 2,6-ДТБГОБ, с отягощающими последствиями, а также со смертельным исходом [14].

Наличие у 2,4-ДТБГОБ и 2,6-ДТБГОБ токсических свойств, применение данных химических веществ в ряде отраслей промышленности, примеры тяжелых (иногда смертельных) отравлений фенольными смесями, включающими 2,4-ДТБГОБ и 2,6-ДТБГОБ, обусловливают интерес к ним как возможным объектам судебно-химического анализа. В подобном качестве 2,4-ДТБГОБ и 2,6-ДТБГОБ практически не изучены. В частности, недостаточно изучен характер распределения этих диалкилпроизводных гидроксибензола в теплокровных организмах после введения их в дозах, приводящих к летальным отравлениям.

Цель исследования — изучение характера распределения 2,4-ДТБГОБ и 2,6-ДТБГОБ в организмах теплокровных (крысы) после отравления животных путем введения им трехкратной LD₅₀.

Исследовали 2,4-ДТБГОБ (CAS N:96−76−4) фирмы «Sigma-Aldrich chemistry» (США) с содержанием основного вещества не менее 99% и 2,6-ДТБГОБ (CAS N:128−39−2) фирмы «Sigma-Aldrich chemistry» (США) с содержанием основного вещества не менее 99%.

Подопытными животными служили крысы-самцы 4-месячного возраста линии Wistar. Исследования проводили по методикам, примененным ранее при изучении распределения отдельных гидроксиароматических соединений [15, 16].

Из подопытных животных сформировали 6 групп — 5 опытных и контрольную (по 5 особей с массой тела 135—150 г в каждой). Каждой особи, относящейся к опытным группам, вводили в желудок с помощью зонда 2,4-ДТБГОБ и 2,6-ДТБГОБ в количестве, соответствующем тройной LD₅₀, так как в доступной литературе не обнаружены сведения о величине LD₅₀ рассматриваемых веществ. Введение тройной LD₅₀, что доказано в эксперименте, гарантированно приводило к гибели всех особей. После наступления гибели животных (в течение 50—90 мин после введения отравляющего вещества) их трупы вскрывали, одинаковые биологические объекты (органы, их содержимое или биожидкости), взятые от особей внутри каждой из опытных групп, объединяли и определяли присутствие в них 2,4-ДТБГОБ и 2,6-ДТБГОБ. Параллельно по данной схеме исследованию подвергали органы и биожидкости животных контрольной группы.

Изолирование. Ткань или содержимое органа (после измельчения до частиц размером 0,2—0,5 см) или биожидкость обрабатывали дважды в режиме настаивания порциями этилацетата при массовом соотношении изолирующего агента и биоматрицы 2:1. Каждое настаивание продолжительностью 45 мин осуществляли в условиях периодического (через каждые 9—10 мин) перемешивания. Отдельные извлечения объединяли в фарфоровой чашке, после чего проводили испарение растворителя из объединенного извлечения сначала в токе воздуха при температуре 18—22 °C до объема 0,5—1,0 мл, а затем в токе азота удаляли остатки растворителя и получали сухой остаток.

Очистка. Сухой остаток, оставшийся в выпарительной чашке в результате удаления растворителя из объединенного извлечения, обрабатывали 2,0—2,5 мл системы органических растворителей гексан-диоксан (8,5:1,5) для 2,4-ДТБГОБ и гексан-диоксан (97,5:2,5) для 2,6-ДТБГОБ. Образующийся раствор наносили на поверхность столба силикагеля L 40/100 мкм массой 10 г, высотой 200 мм и диаметром 10 мм, находящегося в стеклянной бюретке, градуированной на 25 мл, с внутренним размером 490×10 мм. Как только раствор полностью входил в слой сорбента, в колонку начинали добавлять элюенты: гексан-диоксан (8,5:1,5) при исследовании 2,4-ДТБГОБ или гексан-диоксан (97,5:2,5) при исследовании 2,6-ДТБГОБ. Фракции вытекающего элюата объемом 2 мл каждая собирали в отдельные градуированные на 10 мл пробирки. Анализируемое вещество в отдельных фракциях обнаруживали методом ТСХ с использованием стандартных пластин Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ. Незначительные объемы (5—10 мкл) каждой из фракций наносили на хроматографическую пластину и хроматографировали одновременно с веществом-свидетелем в стеклянных цилиндрических камерах вместимостью около 600 см³. В качестве подвижной фазы использовали смеси растворителей гексан-ацетон (9,5:0,5). Хроматограммы проявляли путем облучения УФ-лучами (λ=254 нм). Присутствие 2,4-ДТБГОБ и 2,6-ДТБГОБ в отдельных фракциях определяли по наличию на хроматограмме пятен с величиной Rf, совпадающей с таковой у вещества-стандарта — 0,49±0,03 и 0,74±0,03 соответственно. Фракции элюата, в которых обнаруживали 2,4-ДТБГОБ (в стандартных условиях с 6-й по 10-ю; 12–20 мл) и 2,6-ДТБГОБ (в стандартных условиях с 3-й по 5-ю; 6—10 мл), сливали в одну фарфоровую чашку и испаряли растворитель из объединенного элюата вначале в токе воздуха при температуре 18—22 °C до объема 0,5—1,0 мл, а затем в токе азота удаляли остатки растворителя и получали сухой остаток. Данный остаток растворяли в 5—7 мл этилацетата, количественно переносили в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводили до метки этилацетатом (исходный раствор).

В фарфоровые чашки (№ 1 и № 2) помещали по 1—5 мл исходного раствора, растворитель из порций раствора, находящихся в обеих чашках, испаряли в токе азота до получения сухих остатков.

Идентификация с применением ТСХ. Остаток, находящийся в чашке № 1, растворяли в незначительном количестве ацетона и количественно переносили на линию старта пластины Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ в виде полосы. На линию старта этой же пластины наносили 5—10 мкл раствора (0,08% в этаноле) стандарта 2,4-ДТБГОБ и 2,6-ДТБГОБ (вещества-свидетели). Проводили хроматографию, используя в качестве элюента систему органических растворителей гексан-ацетон (9,5:0,5). Хроматограммы проявляли, облучая их поверхность УФ-лучами (λ=254 нм). Анализируемый аналит идентифицировали по величине абсолютной хроматографической подвижности (Rf).

Идентификация с применением УФ-спектрофотометрии. После идентификации методом ТСХ из хроматограммы вырезали участок с пятном исследуемого вещества, помещали его в пробирку и элюировали аналит 5 или 10 мл этанола в течение 10 мин, перемешивая каждые 2—2,5 мин содержимое пробирки. Часть полученного элюата сливали в кювету и исследовали его светопоглощение в области «кварцевого» ультрафиолета (интервал 200—360 нм). Оптическую плотность (о.п.) измеряли с помощью спектрофотометра марки СФ-2000 в кюветах с толщиной рабочего слоя 10 мм. Если оптическая плотность в области максимумов превыщала 1,3 ед. о.п., элюат разбавляли этанолом.

Идентификация с использованием ВЭЖХ. Остаток, находящийся в чашке № 2, растворяли в 2 мл ацетонитрила, к полученному раствору добавляли 2 мл буферного раствора с pH 5,5 (0,04 М CH₃COONH₄, CH₃COOH). Затем 20 мкл полученного раствора вводили в хроматограф LC-20 Prominance («Shimadzu», Япония) с матричным фотодиодным детектором УФ- и видимого спектров (SPD-M20A). Хроматографировали в изократическом режиме, используя колонку размером 250×4,6 мм Discovery C18 HPLC Column 5 мкм (Supelco) с предколонкой размером 20×4,0 мм Discovery C18 Supelguard Guard Cartridge Kit 5 мкм (Supelco). Температура термостата колонки поддерживалась на уровне 40 °C. Подвижная фаза — ацетонитрил-ацетатный буферный раствор с pH 5,5 (0,04 М CH₃COONH₄, CH₃COOH) (70:30). Скорость потока подвижной фазы составляла 1мл/ мин. Оптическую плотность регистрировали при 280 нм (исследование 2,4-ДТБГОБ) или при 275 нм (исследование 2,6-ДТБГОБ).

Исследуемое вещество идентифицировали по специфическому времени удерживания.

Количественное определение. Исходя из величины оптической плотности этанольного элюата, соответствующей максимуму длинноволновой полосы поглощения 280 нм (исследование 2,4-ДТБГОБ) или 275 нм (исследование 2,6-ДТБГОБ), рассчитывали количественное содержание анализируемых веществ методом УФ-спектрофотометрии.

При идентификации с помощью ТСХ в предлагаемых условиях получали хроматограммы, на которых анализируемые вещества проявлялись в УФ-лучах в виде темных пятен с Rf 0,49±0,03 (2,4-ДТБГОБ) или Rf 0,74±0,03 (2,6-ДТБГОБ), что соответствовало величинам Rf их стандартов.

Спектральные кривые (растворяющая среда — этанол), отражающие характер поглощения УФ-излучения стандартами 2,4-ДТБГОБ и 2,6-ДТБГОБ и этими же веществами, выделенными из ряда органов крыс, изображены на рис. 1.

Такую же схему применяли для исследования биоматериала от крыс контрольной группы, которые не получали 2,4-ДТБГОБ и 2,6-ДТБГОБ. Установили отсутствие данных веществ в извлечениях из тканей органов и биожидкостей животных. Фоновое поглощение этанольных элюатов из участков хроматограмм, по площади и положению соответствующих анализируемым веществам, при аналитической длине волны 280 нм (исследование 2,4-ДТБГОБ) составляло не более 0,026 ед. о.п. (извлечения из органов) и 0,021 ед. о.п. (извлечения из биожидкостей), а при аналитической длине волны 275 нм (исследование 2,6-ДТБГОБ) составляло не более 0,029 ед. о.п. (извлечения из органов) и 0,023 ед. о.п. (извлечения из биожидкостей) в пересчете на 5 г той или иной биоматрицы.

На рис. 2 изображены

Проведенные исследования показали, что при идентификации с помощью ВЭЖХ время удерживания 2,4-ДТБГОБ и 2,6-ДТБГОБ, извлекаемых из биологических объектов, совпадает с соответствующим временем удерживания веществ-стандартов и составляет 9,19±0,10 мин для 2,4-ДТБГОБ и 11,97±0,09 мин для 2,6-ДТБГОБ.

На хроматограммах исследованных соединений, полученных с помощью ВЭЖХ, в области, соответствующей интервалу значений времени удерживания 2,4 ДТБГОБ (8—10 мин) и интервалу значений времени удерживания 2,6-ДТБГОБ (11—13 мин), отсутствовали (по сравнению с хроматограммами веществ-стандартов) дополнительные пики и существенное смещение базовой линии.

Линейная зависимость плотности этанольных растворов 2,4-ДТБГОБ и 2,6-ДТБГОБ (измерение при λ=280 нм и λ=275 нм соответственно) от содержания в них анализируемых веществ соответствует интервалу концентрации 1—100 мкг/мл. Данная зависимость для 2,4 ДТБГОБ описывается уравнением прямой линии, имеющей вид: А=0,013445·С +0,032215, где А — оптическая плотность, С — концентрация анализируемого вещества в фотометрируемом растворе (мкг/мл). Коэффициент корреляции составляет 0,99918. Такая же зависимость для 2,6-ДТБГОБ описывается уравнением: А=0,007912·С+0,009748 с коэффициентом корреляции 0,99934.

При определении 2,4-ДТБГОБ и 2,6-ДТБГОБ в субстанциях методом УФ-спектрофотометрии значения стандартного отклонения S составляют соответственно 0,797 и 0,575, относительного стандартного отклонения S_r — 0,7966 и 0,5783%, относительной ошибки среднего результата ε–, 0,84 и 0,61% (n=6; p=0,95).

Результаты количественного определения 2,4-ДТБГОБ и 2,6-ДТБГОБ в паренхиматозных, полых органах и их содержимом, а также биожидкостях, взятых от отравленных животных, отражающие особенности распределения данных соединений у теплокровных (крысы), приведены в табл. 1 и

Из данных таблиц видно, что оба исследованных соединения присутствуют в неизмененном виде в паренхиматозных и полых органах, содержимом полых органов и в биожидкостях погибших организмов. Согласно полученным результатам, наибольшие количества 2,4-ДТБГОБ и 2,6-ДТБГОБ обнаруживают соответственно в желудке с содержимым – 321,97±38,05 и 471,17±62,60 мг/100 г, селезенке — 31,06±1,97 и 44,73±2,37 мг/100 г и тонкой кишке с содержимым — 30,73±3,05 и 55,57±5,43 мг/100 г. Несколько меньшие количества соединений содержатся в почках, сердце и мочевом пузыре с содержимым.

1. Проведено исследование характера распределения 2,4-ДТБГОБ и 2,6-ДТБГОБ у теплокровных животных (крысы) после однократного внутрижелудочного введения тройной LD₅₀ данных веществ.

2. Рассматриваемые вещества обнаруживаются в неизмененном виде во всех подвергнутых исследованию органах и биожидкостях отравленных животных.

3. Данные по идентификации с помощью ТСХ, УФ-спектрофотометрии и ВЭЖХ позволяют дифференцировать 2,4-ДТБГОБ и 2,6-ДТБГОБ.

4. Наиболее значительные количества 2,4-ДТБГОБ и 2,6-ДТБГОБ обнаружили соответственно в желудке с содержимым — 321,97±38,05 и 471,17±62,60 мг/100 г, селезенке — 31,06±1,97 и 44,73±2,37 мг/100 г и тонкой кишке с содержимым — 30,73±3,05 и 55,57±5,43 мг/100 г.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

¹e-mail: R-WLADIMIR@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0001-8872-0691;

²e-mail: apa2004@mail.ru; https://orcid.org/0000-0001-7002-492X