Разработка методик изолирования, обнаружения и количественного определения алимемазина в биологических жидкостях лабораторных животных при острых отравлениях

Алимемазин — лекарственное средство группы нейролептиков. В медицине используется при психозах, невропатиях, тревожно-депрессивных состояниях, нарушениях сна различного генеза [1]. Фармакодинамические свойства алимемазина позволяют применять его в малых дозах (5—10 мг/сут) для достижения снотворного эффекта, в больших дозах (60—80 мг/сут) — для анксиолитического эффекта. В России препарат разрешен к применению у детей с 7 лет, однако за рубежом его назначают детям младшего возраста.

Алимемазин токсичен в отношении теплокровных животных и человека. LD₅₀ для крыс составляет 210 мг/кг при пероральном введении [2], для людей токсическая доза — более 500 мг/кг.

В литературе [2] описаны случаи передозировки и отравления алимемазином.

За рубежом используют различные объекты для анализа алимемазина: внутренние органы, биологические жидкости, волосы [2—6]. Изолируют алимемазин путем экстракции различными растворителями (этилацетат, н-гептан и др.), а также их смесью. Алимемазин определяют количественно в сыворотке, моче, желудочном содержимом и образцах спинномозговой жидкости методом газовой хроматографии — масс-спектрометрии (ГХ-МС) [4, 5], в образцах цельной крови с помощью ультравысокой эффективной жидкостной хроматографии — тандемной масс-спектрометрии (МС) [6]. Разработанные методики предполагают использование внутренних стандартов, различных условий и режимов хроматографирования. Они высокочувствительны и позволяют определять алимемазин даже в терапевтической концентрации, что не всегда свидетельствует о факте отравления.

Цель исследования — разработка методик изолирования, обнаружения и количественного определения алимемазина в биологических жидкостях (плазма крови, моча) при острых отравлениях лабораторных животных.

Алимемазин — NN-диметил-2-метил-3-(фенотиазин-10-ил)пропиламин является производным фенотиазина [3].

По физическим свойствам алимемазин (М_r=298,4) представляет собой белый или слегка кремовый кристаллический порошок, который темнеет под действием света, температура его плавления — от 159 до 163 °C. Алимемазин легко растворим в воде, умеренно растворим в 96% этаноле, практически не растворим в толуоле и очень мало растворим в эфире [3]; рКа 9,05, log Р (octanol-water) составляет 4,71 [2].

Экспериментальные исследования проводили на крысах линии Wistar обоего пола с массой тела в среднем 200 г в соответствии с международными нормами экспериментальной этики (Европейская конвенция по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей, — Strasbourg, 22 June, 1998).

Алимемазин вводили перорально в виде суспензии с помощью зонда в терапевтической (6,25 мг/кг) и токсичной (210 мг/кг) дозах.

Затем животных вводили в наркоз и проводили декапитацию. Забор биологических жидкостей (кровь, моча) осуществляли через 15, 30 мин, 1, 2 и 3 ч.

Для изолирования алимемазина из плазмы крови использовали методику, учитывающую влияние некоторых факторов экстракции [7]: к 1 мл плазмы крови добавляли 9 мл ацетонитрила, перемешивали и оставляли на 4,5 ч для связывания белка плазмы крови [2]. Далее раствор центрифугировали со скоростью 500 об/мин. Органический растворитель удаляли при комнатной температуре, сухой остаток растворяли в 5 мл 96% этанола.

Для изолирования алимемазина из мочи использовали следующую методику: к 0,5 мл мочи добавляли 0,2 мл хлористоводородной кислоты концентрированной и кипятили 1 ч на водяной бане. После охлаждения добавляли 25% раствор аммиака до рH 12,0 и 3 мл хлороформа. Содержимое взбалтывали в течение 5 мин и помещали в делительную воронку. После разделения фаз отделяли слой органического растворителя, затем удаляли растворители при комнатной температуре. Сухие остатки, которые были получены после испарения экстрагента, растворяли в 5 мл 96% этанола.

Для анализа методом ВЭЖХ использовали прибор Миллихром А-02 (ЗАО «Эконова»). Условия хроматографирования: хроматографическая колонка размером 2×75 мм, заполненная обращенно-фазовым сорбентом ProntoSil 120−5-C18 AQ; подвижная фаза: элюент, А — 0,1% раствор трифторуксусной кислоты, элюент Б — ацетонитрил, скорость потока 100 мкл/мин; время 19 мин; температура 35 °C; объем пробы 5 мкл, аналитическая длина волны 254 нм [8].

Количественное определение алимемазина в извлечениях проводили по стандартному образцу.

Для проведения исследования методом ВЭЖХ/МС использовали анализатор Toxtyper («Bruker») на базе жидкостного хроматографа UltiMate 3000 с масс-детектором AmaZonSpeed («ионная ловушка») в режиме электрораспылительной ионизации (ESI). Состав подвижных фаз: элюент А — вода, 2 мМ формиат аммония; элюент Б — ацетонитрил, 1% (объемн.) воды, 0,1% (объемн.) муравьиной кислоты. Скорость потока 500 мкл/мин, температура 40 °C, объем вводимой пробы 5 мкл. Колонка Acclaim RSLC 120 C18.

Идентификацию алимемазина в биологических жидкостях проводили двумя методами: ВЭЖХ/МС и ВЭЖХ [9].

В исследованиях использовали МС-систему и ВЭЖХ типа «ионная ловушка» Toxtyper («Bruker»).

Масс-спектр извлечения из мочи представлен на рис 1.

На всех масс-спектрах наблюдали выраженный молекулярный ион алимемазина, что достоверно подтверждает присутствие алимемазина в образцах. Масс-спектр контрольного образца не содержал пиков молекулярного иона алимемазина.

Таким образом, с помощью тандемной жидкостной масс-спектрометрии можно с надежной достоверностью идентифицировать алимемазин в биологических жидкостях, что поможет в кратчайшие сроки диагностировать отравление.

Для подтверждения заключения об обнаружении алимемазина и количественного его определения использовали ВЭЖХ. Хроматограмма извлечения из плазмы представлена на рис. 2.

На хроматограмме стандартного образца алимемазина обнаружили один основной пик со временем удерживания 15±0,5 мин, на хроматограмме контрольного образца пиков не выявлено. На хроматограмме извлечения из плазмы крови лабораторных животных наблюдали один пик со временем удерживания 15±0,5 мин, что соответствует времени удерживания стандартного раствора.

Результаты количественного определения алимемазина в извлечениях из плазмы крови представлены в табл. 1.

Полученные данные свидетельствуют, что при введении лабораторным животным терапевтической дозы алимемазин удалось обнаружить через 2 и 3 ч, максимальное количество препарата в извлечении из плазмы крови наблюдали спустя 2 ч. При введении лабораторным животным токсической дозы алимемазин можно обнаружить через 30 мин, 1, 2 и 3 ч, однако максимальное количество алимемазина выявляется через 1 ч.

Методом ГХ/МС был идентифицирован основной метаболит алимемазина — сульфоксид, который обнаружили через 3 ч при введении терапевтической дозы и через 1 ч при введении токсической дозы алимемазина; в моче его удалось идентифицировать через 3 ч при введении терапевтической дозы.

В моче содержание алимемазина определялось только при введении терапевтической дозы, так как препарат оказывает М-холиноблокирующее действие. На полученных хроматограммах извлечений из мочи с терапевтической дозой алимемазина основной пик вещества наблюдали спустя 3 ч (рис. 3).

На хроматограмме извлечения из мочи с терапевтической дозой алимемазина обнаружили основной пик со временем удерживания 15±0,5 мин, что соответствовало времени удерживания стандартного образца алимемазина. На хроматограмме контрольного образца мочи пиков не выявили.

Результаты количественного определения алимемазина в извлечениях из мочи представлены в табл. 2.

Полученные данные свидетельствуют, что в моче обнаруживается 12,46 мкг/мл алимемазина после введения терапевтической дозы спустя 3 ч, что значительно меньше, чем в плазме крови (20,89 мкг/мл).

Таким образом, по прошествии 4,5 ч оптимальной биологической жидкостью для анализа терапевтической и токсической доз алимемазина является плазма крови.

1. Разработаны методики изолирования алимемазина из биологических жидкостей (плазма крови, моча), которые могут быть включены в схему химико-токсикологического анализа алимемазина.

2. Предложены методики идентификации алимемазина с использованием методов ВЭЖХ и ВЭЖХ/МС.

3. Разработана методика количественного определения алимемазина в биологических жидкостях лабораторных животных при введении терапевтической и токсической доз.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

¹e-mail: anna.rybasova@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-6071-4510;

²e-mail: laboratox@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-1977-292Х;

³e-mail: natalya.lyakhova@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0003-0090-1450