Ацетилсалициловая кислота (аспирин; АСК) — лекарственное средство, оказывает противовоспалительное, жаропонижающее, болеутоляющее и антиагрегационное действие; широко применяется в медицине [1, 2].

Это бесцветные кристаллы кисловатого вкуса, с температурой плавления 136,5 °C. Растворимость АСК при температуре 20 °C (в граммах на 100 г) в воде 0,25, в диэтиловом эфире 3,57, в хлороформе 5,9, в этаноле 20. Вещество мало растворимо в бензоле и растворимо в кипящей воде [3, 4].

АСК токсична для теплокровных, ее ЛД50 при внутрижелудочном введении составляет 200 мг/кг для крыс, 250 мг/кг для мышей и 700 мг/кг для собак.

Основной метаболит АСК в организме человека — салициловая кислота (СК). Это бесцветные сладковато-кислые призматические кристаллы, температура плавления их 159 ^оС, мало (1:500) растворимы в воде при температуре 20 ^оС и растворимы (1:15) при температуре 100 ^оС, легко растворимы в этаноле, диэтиловом эфире и ацетоне [4].

Описаны случаи отравления людей АСК, в том числе с летальным исходом. Смертельная доза для взрослых 30—40 г, для детей — 10 г [5—7].

Широкое применение АСК и ее токсическое действие определяют химико-токсикологическое значение этого вещества.

Для изолирования АСК из плазмы крови при клинических исследованиях описано применение экстракции изобутанолом [8]. Известны варианты определения АСК в моче и плазме крови электрохимическими методами без выделения аналита из биологических матриц [9, 10].

Описано исследование биоматериала при летальном отравлении АСК, показавшее присутствие в печени СК (изолирование подкисленной водой), а в крови и желудке  — АСК и СК (экстракция диэтиловым эфиром) [7].

Исследования в области химико-токсикологического анализа АСК фрагментарны и имеют несистематический характер. Многие вопросы ее изолирования, очистки и определения остаются недостаточно разработанными. Доказательство отравления АСК может основываться на определении в органах и биожидкостях как исходного отравляющего вещества, так и его основного метаболита.

Цель исследования — разработка методики определения АСК в тканях органов и крови, применимой в практике судебно-химического анализа.

Исследовали ацетилсалициловую кислоту (ОФС 42−0220−07) и салициловую кислоту (ГФ X) с содержанием веществ 99,5% и более.

Изучали особенности изолирования АСК из биологического материала водой и водными растворами, органическими растворителями и их бинарными смесями. Модельные смеси АСК (размер частиц 5—50 мкм) и мелкоизмельченной (размер частиц 0,2—0,5 мм) ткани печени с содержанием 12,5 мг вещества в 25 г биоматериала выдерживали при температуре 18—20 °С в течение 1,5 ч. Двукратно (по 45 мин) АСК изолировали из модельных смесей при соотношении изолирующего агента и биологического материала 2:1 (по массе). Оба извлечения из каждой модельной смеси объединяли, часть объединенного извлечения хроматографировали на пластинах Силуфол UV-254 (подвижная фаза гексан-ацетон в соотношении 6:4 по объему) На хроматограммах в УФ-свете АСК проявлялась в виде пятна с Rf 0,45±0,02. АСК элюировали из сорбента 95% этанолом и идентифицировали по особенностям поглощения в УФ-части спектра. По оптической плотности элюата при длине волны 278 нм (спектрофотометр СФ-2000, l=10 мм) определяли количество АСК, используя уравнение градуировочного графика. По описанной схеме исследовали зависимость степени извлечения АСК и СК из биоматериала оптимальным изолирующим агентом от ряда факторов, при этом для СК Rf=0,55±0,03, а аналитическая длина волны 301 нм.

Особенности очистки АСК и СК определяли методом колоночной хроматографии. Остаток, полученный после испарения изолирующего агента из извлечения, растворяли в 3 мл ацетона, смешивали раствор с 1,5 г силикагеля L 40/100 мкм и после испарения растворителя вносили смесь в стеклянную колонку размером 190×10 мм, заполненную 8,5 г силикагеля L 40/100 мкм. Элюаты собирали фракциями по 2 мл. АСК и СК обнаруживали во фракциях с помощью ТСХ (пластины Сорбфил UV-254; подвижная фаза гексан—ацетон (в соотношении 6:4; наносимый на пластину объем каждой фракции 5 мкл).

В найденных оптимальных условиях проводили контрольное хроматографирование на колонке извлечения из 25 г ткани печени. Фракции элюата, в которых теоретически возможно присутствие АСК или ее метаболита, объединяли в отдельных выпарительных чашках, испаряли элюент и каждый остаток растворяли в 10 мл ацетона. По 2,5 мл полученных растворов вносили в выпарительные чашки и испаряли растворитель в токе воздуха. К остатку в каждой чашке прибавляли 0,5 мл 10% раствора калия нитрата в 94% серной кислоте, 8,5 мл 10% раствора натрия гидроксида (избыток) и измеряли оптическую плотность водно-щелочного раствора при длине волны 375 нм (условия количественного определения АСК и СК).

Для предварительной идентификации АСК и СК изучали возможность применения нормально фазовой ТСХ. Вещества хроматографировали вместе с внутренним стандартом — 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой (2,4-Д) на пластинах Сорбфил ПТСХ-АФ-В-УФ и Силуфол UV-254.

Для подтверждающей идентификации и количественного определения АСК и СК использовали ГХ МС и электронную спектрофотометрию.

С помощью ГХ МС определение проводили на приборе Agilent Technologies 7890А с масс-селективным квадрупольным детектором модели 5975С, работающим в режиме электронного удара (70 эВ). Температура источника электронов 230 ^оС, температура масс-фильтра 150 ^оС. Регистрацию сигналов проводили по полному ионному току в диапазоне 45—550 m/z).

Изучили оптимальные условия нитрования АСК и СК с последующим получением аци-нитропроизводного для количественного определения данных веществ спектрофотометрическим методом в области УФ-спектра, близкой к видимой, в которой влияние фонового поглощения эндогенных веществ биоматериала незначительно.

Результаты сравнительного изолирования АСК из ткани печени представлены на рис. 1. Вещество в наибольшей степени извлекается ацетоном и его смесями с этилацетатом. В качестве универсального изолирующего агента для извлечения АСК и СК из биологических матриц целесообразно применять смесь ацетон—этилацетат (7:3 по объему). Необходимо как минимум двукратное настаивание биоматериала с изолирующим агентом, массовое соотношение изолирующего агента и биоматериала должно составлять в каждом случае 2 и более, а продолжительность каждого настаивания 45 мин и более.

При хроматографировании на колонке силикагеля L 40/100 мкм смеси АСК и СК вначале элюировали системой гексан—диэтиловый эфир в соотношении 7:3, собирая 10 фракций элюата, затем элюент заменяли на систему гексан—диэтиловый эфир в соотношении 5:5 и элюировали, собирая 20 фракций элюата.

В опытах с тканью печени, не содержащей АСК и СК, показано, что фоновое поглощение водно-щелочного раствора ¼ сухого остатка фракций, в которых возможно присутствие анализируемых веществ, не превышает 0,003 при λ=375 нм (λмакс для количественного определения АСК и СК).

Результаты исследования хроматографической подвижности АСК и СК в тонких слоях сорбентов представлены в табл. 1.

Как видно из данных табл. 1, оптимальными для хроматографирования данных веществ в тонких слоях нормально фазовых сорбентов на пластинах Силуфол UV-254 и Сорбфил ПТСХ-АФ-В-УФ следует считать соответственно подвижные фазы гексан—диэтиловый эфир в соотношении 4:6 и гексан—диэтиловый эфир в соотношении 3:7.

На электронных спектрах АСК и СК в 95% этаноле присутствуют полосы поглощения с максимумами соответственно в области 204 нм (ε=37115) и 206 нм (ε=32290), 230 нм (скрытый) (ε≈14360) и 234 нм (8010), 278 нм (ε=1745) и 301 нм (ε=4580).

Для количественного определения АСК и его основного метаболита спектрофотометрическим методом их переводили в аци-нитросоль путем обработки в течение 5 мин при температуре 20 ^оС 10% раствором нитрата калия в 94% серной кислоте и последующего прибавления избытка 10% раствора натрия гидроксида. По оптической плотности окрашенного раствора в области λ=375 нм оценивали количественное содержание того или иного веществ, используя уравнение градуировочного графика: А =0,062388∙ С+0,013413 (для АСК) и А = 0,064108∙С+0,007009 (для СК), где А — оптическая плотность, С —  концентрация вещества в фотометрируемом растворе в микрограммах на 1 мл. Относительная ошибка среднего результата при определении данной методикой АСК и СК в субстанциях (n=6; p=0,95) не превышает 1,2%.

Для определения АСК и СК методом ГХ МС использовали капиллярную кварцевую колонку HP-5MSD (размер 30 м×0,25 мм, толщина пленки фазы 0,25 мкм). Температура инжектора составляла 280 ^оС, температура испарителя 300 ^оС. Ввод пробы в режиме без деления потока, объем вводимой пробы 2 мкл. Начальная температура термостата колонки 50 ^оС (выдержка 0,5 мин), после чего температуру увеличивали со скоростью 99 ^оС/мин до 100  ^оС (выдержка 1 мин), а затем со скоростью 35 ^оС/мин до 300 ^оС (конечная температура термостата). Время при конечной температуре 23 мин. Газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 1 мл/мин.

На хроматограммах наблюдали пик, соответствующий АСК (время удерживания 4,78 мин) или СК (время удерживания 4,90 мин). Масс-спектр вещества с временем удерживания 4,78 мин включал сигналы ряда осколков массой (m/z) 27 (7,1%), 31 (0,8%), 39 (14,7%), 43 (0,9%), 53 (3,0%), 65 (13,7%), 76 (0,7%), 81 (1,4%), 92 (40,1%), 109 (0,6%), 120 (100%), 138 (2,2%), 148 (0,1%), 166 (34,6%), а с временем удерживания 4,90 мин — сигналы осколков с массой (m/z) 39 (13,6%), 45 (3,5%), 50 (3,6%), 53 (8,3%), 64 (26,8%), 69 (0,7%), 74 (2,1%), 77 (1,0%), 81 (2,5%), 90 (0,3%), 92 (100%), 109 (0,5%), 120 (89,0%), 138 (46,5%).

Открываемый минимум 2·10^–9 г (АСК) и 5·10^–9 г (СК) в хроматографируемой пробе.

Изолирование. 25 г биологического объекта, содержащего АСК и СК, настаивали 2 раза по 30 мин с порциями смеси ацетон—этилацетат (в соотношении 7:3) массой 50 г каждая при перемешивании. Объединенное извлечение пропускали через стеклянный фильтр диаметром 4 см со слоем безводного натрия сульфата толщиной 1,5—2,0 см, слой натрия сульфата промывали 20 мл изолирующего агента. Фильтраты объединяли, растворитель из объединенного фильтрата испаряли при температуре 18—22 ^оС. Остаток растворяли в 2—3 мл ацетона, смешивали раствор с 1,5 г силикагеля L 40/100 мкм и после испарения растворителя вносили смесь в колонку размером 490×10 мм, заполненную 8,5 г силикагеля L 40/100 мкм. Хроматографировали, используя элюент гексан—диэтиловый эфир (в соотношении 7:3). Элюат собирали фракциями по 2 мл. После истечения 10 фракций (№ 1—10) элюент заменяли на смесь гексан—диэтиловый эфир (в соотношении 5:5) и элюировали, собирая 20 фракций элюата (№ 11—30). Фракции с № 4 по № 30 включительно объединяли в выпарительной чашке и упаривали в токе воздуха при температуре 18—22 °С до сухого остатка. Затем остаток растворяли в 10 мл ацетона (исходный ацетоновый раствор). В две выпарительные чашки (№ 1 и № 2) вносили 0,2—2,5 мл и 1—5 мл исходного ацетонового раствора и испаряли растворитель до сухого остатка.

Идентификация методом ТСХ. Остаток в чашке № 1 растворяли в незначительном объеме ацетона и количественно наносили на линию старта пластины Силуфол UV-254. Хроматографировали, используя элюент гексан—диэтиловый эфир (в соотношении 4:6). Хроматограммы детектировали в УФ-свете и идентифицировали вещества по величинам Rf, совпадающим с таковыми веществ-свидетелей (0,70±0,02 для СК и 0,37±0,03 для АСК).

Идентификация методом УФ-спектрофотометрии. После хроматографирования методом ТСХ пятна анализируемых веществ вырезали из хроматограммы, помещали в отдельные пробирки, элюировали каждое вещество из сорбента 95% этанолом 15 мин и исследовали поглощение элюатов в интервале длины волн 200—360 нм. АСК и СК идентифицировали по формам спектральных кривых и положению максимумов 204, ≈230 (скрытый) и 278 нм для АСК и 206, 234 и 301 нм для СК.

Идентификация методом ГХ МС. После хроматографирования методом ТСХ пятна анализируемых веществ вырезали из хроматограммы, помещали в отдельные пробирки, элюировали каждое вещество из сорбента 5 мл 95% этанола 15 мин, элюаты упаривали (каждый) до объема 0,5 мл. Затем 2 мкл полученного раствора вводили в хроматограф фирмы «Agilent Technologies» 7890А с масс-селективным квадрупольным детектором модели 5975С и хроматографировали в условиях, описанных ранее.

Анализируемые соединения идентифицировали по сочетанию времени удерживания вещества в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре.

Количественное определение. Этанольные элюаты после определения методом УФ-спектрофотометрии помещали в отдельные чашки и упаривали до получения сухих остатков. Каждый остаток обрабатывали 0,5 мл 10% раствора нитрата калия в 94% серной кислоте 7,5 мин, реакционную смесь разбавляли 1 мл воды и прибавляли к раствору 8,5 мл 10% раствора натрия гидроксида. По величине оптической плотности образующегося окрашенного раствора, измеряемой при длине волны 375 нм, определяли количественное содержание того или иного анализируемого соединения, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывали на навеску анализируемого вещества, внесенную в биоматериал (табл. 2).

Согласно полученным данным, с изменением содержания АСК и СК в модельных смесях от 1,25 до 50,0 мг при постоянной массе навесок биоматериала (25 г) среднее значение степени извлечения изменяется не более чем на 1,6%. Степень извлечения АСК и СК из ткани печени составляет соответственно 89,64—91,12 и 86,70—88,25%, из крови — 91,12—92,24 и 89,08—90,42%. Открываемый минимум АСК и СК в 100 г печени равен соответственно 0,54 и 0,48 мг, в 100 г крови — 0,46 и 0,38 мг.

Методику применили для идентификации и количественного определения АСК и его основного метаболита при проведении судебно-химической экспертизы случая отравления АСК.

Труп гр-ки С. 1963 г. р. обнаружили в собственной квартире. Рядом лежали пустые упаковки от таблеток, содержащих АСК. Для судебно-химического исследования доставили печень, почки, желудок с содержимым, двенадцатиперстную кишку с содержимым, легкие, кровь и сердце. В результате исследования по предлагаемой схеме в органах трупа и крови выявили и идентифицировали АСК и СК.

Сравнение УФ-спектров в этаноле анализируемых веществ, извлеченных из трупного материала, и стандартов АСК и СК показали, что формы спектральных кривых и положение точек экстремумов анализируемых соединений практически совпадают с таковыми соответствующих стандартов (рис. 2, 3).

В соответствии с полученными данными, масс-спектры анализируемых и стандартных веществ совпадали на 88—93%.

Количественная оценка содержания АСК и СК в трупном материале приведена в табл. 3. Как видно из данных табл. 3, в наибольшей степени АСК присутствовала в желудке с содержимым, двенадцатиперстной кишке с содержимым и почках, а СК — в печени, желудке с содержимым и двенадцатиперстной кишке с содержимым.

Таким образом, разработанная методика может быть применена при экспертизе случаев отравления АСК.

1. Показана целесообразность и определены оптимальные условия изолирования ацетилсалициловой кислоты из биологического материала смесью растворителей этилацетат—ацетон (7:3).

2. Разработана универсальная методика определения ацетилсалициловой кислоты и ее основного метаболита в тканях трупных органов и биожидкостях на основе изолирования рассматриваемой смесью растворителей и очистки методом колоночной хроматографии.

3. Для идентификации и оценки количественного содержания исследуемого вещества в биологических объектах предложены методы ТСХ, электронной спектрофотометрии и ГХ МС.

4. Показана возможность применения разработанной методики для исследования экспертного материала.

Конфликт интересов отсутствует.