В настоящее время в РФ наблюдается тенденция к злоупотреблению некоторыми новыми холиноблокаторами. Их принимают вместо традиционных наркотиков и психоактивных веществ как менее дорогие и более доступные. Прием их не считается уголовно наказуемым деянием. В последние годы в стране отмечены случаи немедицинского употребления следующих холинолитических лекарственных средств: тригана Д (действующее вещество дицикловерин), цикломеда (действующее вещество циклопентолат), тропикамида. Эти препараты применяют в немедицинских целях различные категории населения. Цикломед, как правило, используют молодые люди от 16 до 20 лет, которые подбирают «подходящие» для себя и доступные лекарственные препараты с целью привести себя в состояние одурманивания [1].

В немедицинских целях цикломед применяют интраназально с превышением терапевтической дозы в несколько раз с целью развития зрительных и слуховых галлюцинаций, изменения эмоционального состояния. Эффект такого применения — дезориентация в пространстве, искажение речи и зрения, провалы в памяти и пр., характерные для передозировки препарата. В литературе имеются клинические данные о злоупотреблении циклопентолатом (цикломед) больными, которые находятся на лечении от алкогольной и героиновой зависимости [2].

Методики химико-токсикологического анализа вещественных доказательств и биологических жидкостей при отравлениях циклопентолатом отсутствуют и не позволяют сделать заключение об использовании этого лекарственного препарата в немедицинских целях, в том числе при приеме совместно с наркотическими, психотропными средствами.

Цель исследования — разработка методик химико-токсикологического анализа циклопентолата в вещественных доказательствах и биологических жидкостях при судебно-химической и химико-токсикологической экспертизе.

Цикломед (1% раствор), действующее средство — циклопентолата гидрохлорид; химическое название — 2-диметиламиноэтил-2-(1-гидроксициклопентил)-2-фенилацетата гидрохлорид. Препарат хорошо всасывается через конъюнктиву, определяемая концентрация в ЦНС достигается через 0,5—1 ч. Циклопентолат через 0,5—2 ч на 40—60% связывается с белками плазмы крови [3].

Нафтизин (0,1% раствор) по фармакологическому действию относится к адреномиметикам, влияющим преимущественно на α-адренорецепторы; действующее средство — нафазолина нитрат; химическое название — 2-(α-нафтилметил)-имидазолина нитрат. Данные о фармакокинетике и фармакодинамике препарата в доступной литературе не обнаружены.

Тропиконамид (1% раствор), по фармакологическому действию относится к М-холиноблокаторам, используется при лечении глазных болезней.

Вещества кодеин, морфин выделены из токсидисков системы TOXI-LAB.

Биологические жидкости (кровь, моча) экспериментальных животных (крысы).

При проведении исследования в качестве рабочего стандартного образца (РСО) использовали циклопентолат, выделенный из лекарственной формы (капли) 1% раствора цикломеда, подлинность и чистота которого были подтверждены химическими и физико-химическими методами анализа [4].

При разработке методики химико-токсикологического анализа цикломеда в вещественных доказательствах и биологических жидкостях использовали следующую аппаратуру: ультрафиолетовый (УФ) спектрофотометр марки СФ 2000; жидкостный хроматограф Agilent 1200 с диодно-матричным детектором (ДМФ); газовый хроматограф Agilent HP 6850 с масс-селективным детектором НР 5973N фирмы «Hewlett Packard» (США); пластинки Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ с полимерной подложкой.

Для проведения цветных и осадочных реакций и физико-химических исследований использовали реактивы Драгендорфа, Марки, Манделлина, Бушарда—Вагнера, серную и азотную концентрированные кислоты, 0,1 М раствор хлористоводородной кислоты, аммиак водный, натрия сульфат безводный; растворители марок ХЧ и ЧДА: хлороформ, этанол, ацетон, 2-пропанол, этилацетат, гексан, ацетонитрил.

Изолирование циклопентолата из водных растворов проводили различными растворителями (хлороформ, этилацетат, гексан и смесь хлороформ-2-пропанол в соотношении 9:1) при значениях рН среды от 2,0 до 12,0. Процент извлечения циклопентолата из водных растворов определяли методом УФ-спектроскопии в 0,1 М растворе хлористоводородной кислоты при длине волны 257 нм по заранее построенному калибровочному графику.

Максимальное извлечение циклопентолата из водного раствора наблюдали при рН среды 10,0 с помошью смеси хлороформ-2-пропанол в соотношении 9:1 (75%), хлороформа (65%), этилацетата (53%) и гексана (46%). Использование высаливающего агента натрия хлорида при экстракции не повышало процента извлечения анализируемого вещества.

Методика изолирования анализируемого вещества из вещественных доказательств (раствор цикломеда): к части раствора цикломеда добавляли очищенную воду при рН среды 10,0, затем переносили в делительную воронку и 3 раза по 5 мл в течение 5 мин проводили экстракцию смесью хлороформ-2-пропанол (9:1). Органический слой отделяли, пропускали через натрия сульфат безводный, вытяжки объединяли и выпаривали в токе теплого воздуха до сухого остатка.

Для идентификации основания циклопентолата, выделенного из цикломеда, апробировали следующие методы: цветные и осадочные реакции [5], тонкослойную хроматографию (ТСХ), УФ-спектроскопию, высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) и газовую хроматографию с масс-селективным детектором (ГХ/МС) [6, 7].

Если обстоятельства проведения исследования (на месте происшествия) или оснащение лаборатории не позволяют использовать сложную высокочувствительную аппаратуру, цветные и осадочные реакции проводят в качестве одного из предварительных этапов исследования (табл. 1). Готовили раствор с известной концентрацией (0,1 мг/мл) в хлороформе или этаноле, затем его разбавляли соответствующим растворителем в мерных колбах и микрошприцем отбирали аликвотную часть с определенным количеством в растворе циклопенталата; растворитель упаривали в токе теплого воздуха и определяли предел обнаружения исследуемого вещества.

ТСХ на предварительном этапе служит основным источником информации в судебно-химическом и химико-токсикологическом анализе [7]. Хроматографическое исследование циклопентолата проводили методом одномерной восходящей хроматографии в различных системах растворителей на пластинках Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ с полимерной подложкой (табл. 2).

Установлено, что оптимальной системой растворителей для определения циклопентолата методом ТСХ совместно с тропикамидом, нафазолином, морфином и кодеином является система этилацетат — этанол — аммиак водный (17:3:1) [8].

Для идентификации циклопентолата, выделенного из раствора, использовали УФ-спектроскопию. В УФ-спектрах, полученных в 0,1 М растворе хлористоводородной кислоты, максимум поглощения циклопентолата наблюдается при длине волны 252, 258 и 264 нм. Записанные спектры оказались идентичны спектрам, приведенным в литературе [4, 6].

Для исследования цикломеда, содержащего циклопентолат, совместно с тропикамидом и нафазалином использовали ГХ/МС и оборудование фирмы «Hewlett Packard» (США): газовый хроматограф Agilent HP 6850 (с масс-селективным детектором НР 5973N), капиллярную колонку НР-5 MS (5% фенилметилсилоксан) внутренним диаметром 0,25 мм и длиной 30 м, газ-носитель гелий, скорость которого 0,8 мл/мин, температура от 80 (0,5 мин) до 100 °C, конечная температура 290 °C, объем пробы 1 мкл.

Для хроматографирования использовали сухой остаток хлороформного извлечения, который растворяли в 100 мкл метанола. Фиксировали время удержания для циклопентолата 7,95 мин. В масс-спектре наблюдали характерные пики ионов с m/z 58, 71, 72, 207, 42, 91, 59 и 118; полученный спектр совпадал с данными библиотек. Для нафазолина и тропикамида время удержания этим методом в данных условиях составляло 12,45 и 16,3 мин соответственно (рис. 1).

Для идентификации и количественного определения циклопентолата применили ВЭЖХ, позволяющий выделить вещество из сложных смесей органических соединений и одновременно проанализировать его и качественно, и количественно.

Анализ проводили с помощью оборудования фирмы «Agilent»: жидкостный хроматограф Agilent 1200 с ДМД; предколонка Zorbax Eclipse XDB — C 185 мкм 4,6×12,5 мм, колонка Zorbax Eclipse XDB — C 185 мкм 4,6×150 мм; скорость подачи подвижной фазы 1 мл/мин; время регистрации хроматограммы 8 мин; подвижная фаза: ацетонитрил, фосфатный буфер рН 3,0 (60:40); температура термостата колонки 40 °C; объем вводимой пробы 2 мкл; режим анализа градиентный; длина волны детектирования 210 нм. Фиксировали время удержания циклопентолат — 6,17 мин, нафазолин — 5,21 мин, тропикамид — 4,25 мин (рис. 2).

Таким образом, для установления наличия циклопентолата в объектах исследования, доставленных на судебно-химическую экспертизу или химико-токсикологическое исследование с места происшествия в качестве вещественных доказательств, следует использовать методы ТСХ, ВЭЖХ, ГХ/МС и УФ-спектроскопию, а также цветные и осадочные реакции.

Определение циклопентолата в биологических объектах

Для определения процента извлечения циклопентолата из биологических жидкостей готовили модельные комплексы. Использовали образцы мочи и крови от здоровых добровольцев, не принимавших лекарственные препараты в течение 1 мес до отбора проб. Модельные смеси мочи и крови готовили путем добавления рабочего стандартного раствора с концентрацией 10 мг/мл к биожидкостям до получения концентраций 0,5, 1,0, 2,0 мг/мл. Приготовленные модельные смеси инкубировали при температуре 37 °C в течение 2 ч. Процент извлечения циклопентолата из биологических жидкостей определяли методом УФ-спектрофотометрии (табл. 3).

Кровь в количестве 4—5 мл разводили очищенной водой, добавляли натрия вольфрамата раствор 10% в объеме, равном количеству очищенной воды, и серной кислоты раствор 10% до рН среды 2,0. Полученный раствор переносили в центрифужную пробирку, центрифугировали в течение 5 мин. Центрифугат, полученный после осаждения белков и форменных элементов крови, переносили в делительную воронку, доводили до рН среды 10,0 аммиаком водным и экстрагировали смесью хлороформ-2-пропанол (9:1) порциями по 5 мл 3 раза. Извлечения объединяли и пропускали через слой натрия сульфата безводного в фарфоровые чашки и испаряли до сухого остатка.

Мочу исследовали с помощью жидкость-жидкостной экстракции при рН среды 10,0 смесью хлороформ-2-пропанол (9:1) трехкратно порциями по 5 мл. Извлечения объединяли, пропускали через слой натрия сульфата без-водного в фарфоровые чашки и испаряли до сухого остатка.

Разработанные методики химико-токсикологического анализа циклопентолата основания в биологических жидкостях были апробированы на экспериментальных животных, поскольку они в определенной степени воспроизводят процессы, происходящие с ксенобиотиками, при введении последних в живой организм.

Провели исследование на 15 беспородных белых крысах-самцах массой 180—220 г. Раствор цикломеда вводили однократно внутрибрюшинно в количестве 1 мг действующего вещества с последующим введением водной нагрузки. Результаты сравнивали с данными контрольной группы из 5 животных, которым внутрибрюшинно вводили воду для инъекций. Забор крови производили из десны через 1 и 2 ч, забор мочи — в течение 24 ч. На анализ взяли по 3 мл крови и 4—5 мл мочи от каждого животного.

Изолирование циклопентолата основания из биологических жидкостей животных проводили по разработанной нами методике с использованием твердофазной экстракции (ТФЭ), основанной на использовании патронов с различными сорбционными свойствами, что позволяет избирательно адсорбировать на поверхности сорбента патрона вещества разной химической природы. Основные преимущества метода по сравнению с традиционными — возможность одновременного выделения и концентрирования исследуемого вещества, а также значительное увеличение скорости и эффективности экстракции. Экстракцию исследуемого вещества проводили на патронах марки Oasis HLB. Эти патроны обладают гидрофильно-липофильной двойственностью и способны адсорбировать на себе вещества разной химической природы. Патроны промывали 1 мл метанола и 1 мл воды очищенной, затем загружали 1 мл биологической жидкости (моча или плазма крови). Для извлечения лекарственных средств патроны промывали 1 мл 5% раствора метанола и элюировали 1 мл смеси хлороформ-2-пропанол (9:1). Элюат выпаривали досуха и исследовали физико-химическими методами. Часть сухого остатка растворяли в 1 мл ацетонитрила сорта 0 и проводили количественное определение циклопенталата методом ВЭЖХ. Удалось увеличить экстракцию циклопенталата основания методом ТФЭ по сравнению с жидкость-жидкостной экстракцией в 2 раза (табл. 4). Методом ТФЭ подобрать условия для экстракции анализируемого вещества из мочи не удалось.

Анализ извлечений из биологических жидкостей после очистки проводили методами ТСХ, УФ, ВЭЖХ и ГХ/МС. Циклопентолат обнаружили в извлечениях из крови через 1 и 2 ч, однако через 3 ч препарат не выявили. При исследовании извлечения из мочи крыс, собранной в течение 24 ч, методом ГХ/МС обнаружили циклопентолат и его метаболиты (рис. 3, 4).

При исследовании методом ТСХ наблюдали пятна, по значению Rf, окраске и флюоресценции соответствующие циклопентолата основанию, выделенному из раствора цикломеда. Методы ВЭЖХ (кровь 6,22; моча 6,25) и ГХ/МС (кровь 7,80; моча 7,84) показали, что время удерживания и масс-спектр вещества, выделенного из биожидкостей, совпадали с таковыми, полученными при анализе циклопентолата, выделенного из раствора цикломеда.

Для количественного определения циклопентолата в биологических жидкостях мы предлагаем методы ВЭЖХ (калибровочный график) и масс-спектрометрии (метод внутреннего стандарта), для которых нами разработаны определенные методики. Расхождение результатов количественного определения, полученных различными методами, не превышает 5% (см. табл. 4).

Для метода ВЭЖХ были определены некоторые валидационные характеристики. Параметр линейности определяли путем измерения растворов исследуемых веществ на 5 уровнях концентраций. Значение коэффициента корреляции находилось в пределах 0,99<R<1,0. Прецизионность метода устанавливали по показателям «сходимость» и «внутрилабораторная воспроизводимость». Относительное стандартное отклонение при оценке этих показателей не превышало 2,3% (при RSD <3% изменчивость вариационного ряда считается незначительной). Таким образом, полученные данные являются сходимыми, а методика воспроизводима.

1. Изолирование из вещественных доказательств анализируемого вещества следует проводить с помощью жидкость-жидкостной экстракции смесью хлороформ-2-пропанол (9:1) при рН среды 10,0, а из биожидкостей в тех же условиях после предварительного осаждения белков для крови и без предварительного кислотного гидролиза для мочи.

2. Установлено, что методы ТСХ, ГХ/МС, ВЭЖХ, УФ-спектроскопия позволяют идентифицировать компонент препарата цикломед в вещественных доказательствах и биологических жидкостях.

3. Разработаны условия для количественного определения циклопентолата, выделенного из биологических жидкостей, методами высокоэффективной жидкостной хроматографии, хромато-масс-спектрометрии.

Конфликт интересов отсутствует.