Дилтиазем — D-цис-3-Ацетокси-2,3-дигидро-5-[2-(диметиламино)этил]-2-(2-метоксифенил)-1,5-бензотиазепин-4 (5Н)-она гидрохлорид — применяется как антагонист ионов кальция при стенокардии, ИБС и гипертонической болезни, а также обладает антиаритмической активностью [1, 2].

Это белый или не совсем белый кристаллический порошок с горьким вкусом, температура плавления 213 °C, легко растворим в воде, метаноле, дихлорметане, плохо растворим в этаноле [3, 4].

Дилтиазем обладает выраженными токсическими свойствами по отношению к теплокровным организмам и может вызывать отравление различной степени тяжести. Его LD50 при внутрижелудочном введении лабораторным животным колеблется от 190±14,61 до 140±14,23 мг/кг (р<0,05) [2]. Зафиксированы летальные отравления дилтиаземом людей на территории Российской Федерации и за рубежом [3, 5—7].

Широкое применение дилтиазема в медицинской практике, его токсические свойства, наличие случаев летального отравления делают его важным объектом судебно-химического анализа.

Для изолирования дилтиазема из трупного материала используют классические методы, которые не позволяют достичь высокой степени изолирования рассматриваемого вещества (степень извлечения 7—30%) и относительно малочувствительны [3, 8].

Ряд известных вариантов исследования дилтиазема в биологическом (трупном) материале, основанных на изолировании метанолом и ацетонитрилом, не предусматривают достаточно высокой степени очистки, что не позволяет в полной мере использовать возможности современных высокочувствительных методов анализа [8].

Недостаточно высокая степень извлечения дилтиазема из биоматериала и очистки аналита от соэкстрактивных веществ биологических матриц характеризует универсальный метод пробоподготовки QuEChERS, а также метод, основанный на замораживании биологического объекта до температуры –70 °С с последующей ультразвуковой обработкой [9, 10].

Таким образом, несмотря на очевидное судебно-химическое значение дилтиазема, в химико-токсикологическом отношении он изучен недостаточно. Например, требуют дальнейшей разработки вопросы извлечения его из биоматериала, очистки и определения в извлечениях.

Цель настоящего исследования — определение оптимальных условий изолирования дилтиазема, его очистки сочетанием методов экстракции и колоночной хроматографии и разработка универсальной методики определения дилтиазема в биологическом материале.

Объект исследования — субстанция дилтиазема гидрохлорида с содержанием основного вещества не менее 99,9%, соответствующая НД.

Изучали особенности изолирования дилтиазема из биологического материала 12 органическими растворителями, водой и водными растворами различной реакции. Для этого готовили модельные смеси дилтиазема (размер частиц 5—50 мкм) и мелкоизмельченной (размер частиц 0,2—0,5 мм) ткани печени с содержанием 12,5 мг вещества в 25 г биоматериала, которые выдерживали 1,5 ч при температуре 18—20 °С. Осуществляли двукратное (по 45 мин) изолирование дилтиазема при соотношении изолирующего агента и биоматериала 2:1 (по массе). Оба извлечения из каждой модельной смеси объединяли, часть объединенного извлечения хроматографировали на пластинах Сорбфил ПТСХ-АФ-В-УФ (подвижная фаза хлороформ—ацетон; 5:5 по объему). На хроматограммах в УФ-свете дилтиазем определялся в виде темного пятна с Rf 0,57±0,03. Вещество элюировали этанолом в течение 15 мин и идентифицировали по особенностям поглощения элюата в УФ-части спектра. По величине оптической плотности элюата, измеренной при длине волны 278 нм (спектрофотометр СФ-56, длина оптического пути 10 мм), определяли количество дилтиазема, используя уравнение градуировочного графика.

По наибольшему значению степени извлечения дилтиазема из биоматериала определяли оптимальный изолирующий агент. С помощью описанной схемы изолирования, очистки и определения дилтиазема исследовали зависимость величины степени его извлечения из биоматериала оптимальным изолирующим агентом от продолжительности контакта изолирующей жидкости с биоматериалом, кратности настаивания и количественного соотношения изолирующего агента и биологической ткани.

При моделировании условий очистки дилтиазема от соэкстрактивных веществ биологических матриц методом жидкость-жидкостной экстракции иссследовали особенности распределения дилтиазема в системах из двух несмешивающихся фаз (водная и органическая) в зависимости от природы органической фазы, рН водной среды, кратности экстракции, влияния насыщения водной фазы электролитами, природы электролита.

Определяя возможность очистки дилтиазема методом обращенно-фазовой колоночной хроматографии, изучали особенности его хроматографического поведения в колонке 120×11 мм, заполненной 7,5 г сорбента Силасорб С-18 30 мкм. Элюенты — полярные растворители (ацетонитрил, диоксан, ацетон) с различным содержанием воды. Элюаты собирали фракциями по 2 мл каждая. Дилтиазем обнаруживали во фракциях методом ТСХ [пластины Сорбфил ПТСХ-АФ-В-УФ, подвижная фаза ацетон—хлороформ (5:5), объем фракции, наносимый на пластину, 5—10 мкл].

Параллельно осуществляли контрольное хроматографирование на колонке извлечения из 25 г ткани печени. Фракции элюата, в которых теоретически возможно присутствие анализируемого вещества, объединяли, испаряли, растворяли остаток в 25 мл этанола и измеряли оптическую плотность раствора при 278 нм (растворитель и длина волны соответствуют условиям определения дилтиазема методом спектрофотометрии).

Для предварительной идентификации дилтиазема изучили возможность применения нормально-фазной ТСХ. Вещество хроматографировали на пластинах Сорбфил ПТСХ-АФ-В-УФ в подвижной фазе ацетон—хлороформ (5:5). Для подтверждающей идентификации и количественного определения дилтиазема рассмотрена возможность применения фотометрических методов и хромато-масс-спектрометрии (вариант ГХ МС).

Изучали особенности светопоглощения дилтиазема в различных жидких средах органической и неорганической природы с применением спектрофотометра СФ-56 и кварцевых кювет (толщина рабочего слоя 10 мм).

Для фотометрических определений в видимой области вводили в структуру дилтиазема электрофильный заместитель (нитрогруппа) и получали аци-нитросоль образующегося нитропроизводного.

При определении дилтиазема методом ГХ МС использовали газовый хроматограф фирмы «Agilent Technologies» (США) модели 6890N с масс-селективным квадрупольным детектором модели 5973N («Agilent Technologies») и колонку DB-1MS («J&W Scientific», США) с неподвижной жидкой фазой диметилполисилоксан (длина колонки 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки фазы 0,25 мкм). Масс-селективный детектор работал в режиме электронного удара (70 эВ). Обнаружение вещества проводили в режиме регистрации по полному ионному току (диапазон сканирования 40—550 m/z).

Как свидетельствуют полученные результаты, наибольшая степень извлечения достигается при использовании в качестве изолирующего агента ацетона (рис. 1).

Для максимально эффективного извлечения дилтиазема ацетоном из ткани печени необходимо как минимум двукратное настаивание биоматериала с изолирующим агентом, если количество ацетона в каждом случае превышает количество биоматериала как минимум в 2 раза по массе, а продолжительность каждого настаивания составляет не менее 45 мин.

Изучение экстракции дилтиазема показало, что он в наибольшей степени извлекается гидрофобными растворителями из щелочных растворов, а оптимальным экстрагентом является диэтиловый эфир; коэффициент распределения (если r =1) равен 49—62,7 при рН 10,0—12,0. Введение электролитов (калия хлорид, декагидрат сульфата натрия, аммония сульфат) в водную фазу коэффициент распределения заметно не изменяет.

Результаты изучения хроматографического поведения дилтиазема в колонке обращенно-фазового сорбента приведены в табл. 1.

Как свидетельствуют полученные данные, подвижные фазы на основе ацетонитрила, диоксана и ацетона с содержанием 7—15% воды обеспечивают достаточно компактный выход вещества из колонки Силасорб С-18 30 мкм в фракциях № 5—20 (10—40 мл) элюата. В качестве оптимальной для очистки дилтиазема выбрана подвижная фаза на основе ацетонитрила, содержащая 9% воды (соотношение ацетонитрил—вода 9,1:0,9). При ее применении дилтиазем элюируется фракциями № 8—9 (4 мл).

В опытах с трупной тканью, не содержащей дилтиазема, установили, что фоновое поглощение раствора ¼ сухого остатка фракций, в которых возможно присутствие данного вещества, в этаноле незначительно и не превышает 0,009 при длине волны 278 нм.

На электронных спектрах дилтиазема в различных средах (хлороформ, 95% этанол, ацетонитрил, 0,1 н. раствор хлороводородной кислоты, вода и 0,1 н. раствор гидроксида натрия) обнаружили присутствие выраженных полос поглощения в области 205—210 нм (ε=37934,4—66037,7), 237—242 нм (ε=13545,9—50579,2) и в области 278—281 нм (ε=2531,4—4768,2). В дальнейшем средой для определения дилтиазема методом спектрофотометрии выбрали 95% этанол.

Установлено, что в реакции с нитратом калия в среде концентрированной серной кислоты дилтиазем при температуре 18—22 °С переходит в нитропроизводное, образующее в водно-щелочной среде окрашенный продукт (аци-нитросоль). Подчинение основному закону светопоглощения для реакции нитрования дилтиазема и последующего получения аци-нитросоли соответствует интервалу концентраций 2,5—200 мкг/мл. Градуировочный график (коэффициент корреляции r≥0,99) имеет вид: А=0,010171∙С+0,089425 (А — оптическая плотность, С — концентрация вещества в фотометрируемом растворе). При определении дилтиазема методом спектрофотометрии в субстанции относительная ошибка среднего результата не более 1,2%.

Для определения дилтиазема методом ГХ МС предложены условия, при которых начальная температура термостата колонки составляла 80 °C (задержка на 2 мин). Температуру программировали от 80 до 250 °C со скоростью 40 °С/мин с выдержкой при конечной температуре 6 мин. Температура инжектора составляла 280 °C, температура интерфейса — 300 °C. Газ-носитель — гелий, скорость подачи которого 39 см/с. Объем вводимой пробы 1 мкл, пробу вводили в режиме без деления потока, задержка 3 мин. В данных условиях на хроматограммах наблюдали пик (время удерживания 11,7 мин), соответствующий дилтиазему. Масс-спектр вещества, соответствующего данному пику, включает сигналы ряда осколков с характерными массами (58, 77, 104, 121, 150, 178). Основным, масса которого принимается за 100%, является осколок массой 58.

Сочетание сигналов характерных осколков в масс-спектре и времени удерживания в колонке обеспечивает достаточно высокую селективность идентификации рассматриваемого соединения методом ГХ М.С. Открываемый минимум дилтиазема составляет при этом 0,2 · 10^–9 г в хроматографируемой пробе.

Изолирование. 25 г биологического объекта, содержащего дилтиазем, настаивали дважды по 45 мин с порциями ацетона массой 50 г каждая при перемешивании, затем объединяли извлечения. Объединенное извлечение пропускали через стеклянный фильтр диаметром 4 см со слоем безводного сульфата натрия толщиной 1,5—2,0 см, затем слой сульфата натрия промывали 20 мл изолирующего агента. Фильтраты объединяли, растворитель из объединенного фильтрата испаряли при комнатной температуре.

Очистка экстракцией. Остаток растворяли в 10 мл 0,1 М раствора хлороводородной кислоты, раствор фильтровали через бумажный фильтр, фильтр промывали 10 мл 0,1 М раствора хлороводородной кислоты. Фильтрат и промывную жидкость объединяли, доводили рН раствора 1 М раствором натрия гидроксида до 8,0—9,0 и экстрагировали диэтиловым эфиром дважды по 40 мл. Экстракты объединяли в выпарительной чашке и испаряли в токе воздуха до сухого остатка.

Очистка колоночной хроматографией. Остаток, полученный после очистки экстракцией, растворяли в 2 мл смеси ацетонитрил—вода (9,1:0,9) и вносили данную смесь в хроматографическую колонку размерами 120×11 мм, заполненную 7,5 г Силасорб С-18 30 мкм. Хроматографировали, используя элюент ацетонитрил—вода (9,1:0,9). Элюат собирали фракциями по 2 мл. Фракции № 8 и № 9 объединяли, испаряли в токе воздуха при температуре 20—22 °С. Остаток растворяли в 10 мл ацетона (исходный ацетоновый раствор). В две выпарительные чашки (№ 1 и № 2) вносили соответственно 0,1—2,0 и 1,0—2,5 мл исходного ацетонового раствора и испаряли растворитель.

Идентификация методом ТСХ. Остаток в чашке № 1 растворяли в незначительном объеме ацетона и количественно наносили на линию старта хроматографической пластины Сорбфил ПТСХ-АФ-В-УФ. Хроматографировали, применяя систему хлороформ—ацетон (5:5), в присутствии вещества-свидетеля. Хроматограммы детектировали в УФ-свете и идентифицировали анализируемое вещество по величине Rf, совпадающей с таковой вещества-свидетеля (0,57±0,03).

Идентификация методом УФ-спектрофотометрии. После хроматографирования методом ТСХ пятно вещества вырезали из хроматограммы, помещали в пробирку, элюировали вещество из сорбента 95% этанолом в течение 15 мин и исследовали поглощение элюата в интервале длин волн от 200 до 360 нм. Соединение идентифицировали по форме спектральной кривой и положению максимумов поглощения (210, 242 и 278 нм). УФ-спектры в этаноле стандарта дилтиазема и дилтиазема, извлеченного из биоматериала, сравнивали: формы спектральных кривых и положения полос поглощения практически совпадают (рис. 2).

Идентификация методом ГХ МС. Остаток в чашке № 2 растворяли в 25 мл гексана. Затем 2—10 мкл полученного раствора вводили в испаритель газового хроматографа. 2 мкл полученного раствора вводили в хроматограф типа Agilent Technologies (США) модели 6890N с масс-селективным квадрупольным детектором модели 5973N («Agilent Technologies») и хроматографировали при описанных ранее условиях.

Дилтиазем идентифицировали по сочетанию времени удерживания вещества в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре.

На рис. 3 и 4 приведены хроматограммы и масс-спектры стандарта дилтиазема, а также дилтиазема, выделенного из трупной печени и крови.

Как свидетельствуют полученные данные, обнаруживается совпадение масс-спектров анализируемого и стандартного веществ на 86%.

Количественное определение. Этанольный элюат после идентификации методом УФ-спектрофотометрии упаривали в выпарительной чашке до сухого остатка, остаток 7,5 мин обрабатывали 0,5 мл 10% раствора нитрата калия в концентрированной серной кислоте. Реакционную массу разбавляли 1 мл воды, к полученной смеси добавляли 4,5 мл 20% раствора гидроксида натрия и измеряли оптическую плотность образующегося окрашенного раствора при длине волны 303 нм на фоне раствора, полученного в контрольном опыте. Количественное содержание дилтиазема определяли, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывали на навеску анализируемого вещества, внесенную в биоматериал. Результаты представлены в табл. 2.

Согласно полученным данным, изменение содержания дилтиазема в модельных смесях от 2,5 до 50,0 мг при постоянных массах навесок биоматериала (25 г) сопровождается изменением среднего значения степени извлечения, не превышающим 1,7%. При содержании дилтиазема в количестве 25 мг в 25 г биоматериала разработанная методика позволяет определить в ткани печени 90,71%, в крови 90,91% данного вещества. Открываемый минимум методики (в 100 г биологического объекта) составляет 0,5 мг вещества в печени и 0,4 мг в крови.

Таким образом, разработанная методика может быть применена при исследовании тканей трупных органов и биожидкостей на присутствие в них дилтиазема.

1. Обоснована целесообразность и определены оптимальные условия применения ацетона в качестве изолирующего агента для извлечения дилтиазема из биологического материла.

2. Показана возможность очистки дилтиазема, извлекаемого из биологических объектов, сочетанием жидкость-жидкостной экстракции и хроматографии в колонке сорбента Силасорб С-18 30 мкм.

3. Разработана универсальная методика определения дилтиазема в тканях трупных органов и крови на основе изолирования рассматриваемым растворителем.

4. Для идентификации и оценки количественного содержания исследуемого вещества в биологических объектах предложены методы ТСХ, спектрофотометрии и ГХ МС.