Карбофуран (О-(2,3-дигидро-2,2-диметилбензофуранил-7)-N-метилкарбамат (синонимы: фурадан, дайфуран, хинуфур, бетафур, адифур) — биологически активное вещество с антихолинэстеразной активностью, применяющееся в качестве средства защиты растений.

Карбофуран — белый кристаллический порошок или бесцветные кристаллы без запаха, температура плавления 153—154 °С. При температуре 25 °С он плохо растворим в воде (0,7 г в 100 г), значительно лучше — в этаноле (4 г в 100 мл), дихлорметане (2 г в 100 мл), ацетоне (15 г в 100 мл) [4, 6].

Карбофуран обладает высокой токсичностью. LD50 этого вещества для крыс при пероральном введении составляет 8—14 мг/кг [2, 3, 5].

Отравления людей данным соединением с летальным исходом за период с 2003 по 2012 г. неоднократно отмечались в Курской области и Республике Татарстан [1, 6, 7].

В химико-токсикологическом отношении карбофуран изучен недостаточно. В практике судебно-химического анализа иногда используют методики определения карбофурана в объектах окружающей среды и продуктах питания, малоадаптированные к исследованию трупного материала [3]. Описаны варианты определения этого соединения в ткани трупной печени на основе изолирования подкисленной водой [1] и этилацетатом [6]. Для изолирования карбофурана из крови и мочи известно применение прямой экстракции хлористым метиленом [1] или настаивания со смесью растворителей этилацетат—ацетон (1:1) [7].

Цель исследования — разработка универсальной методики выявления карбофурана в тканях трупных органов и биологических жидкостях, которую можно применять в практике судебно-химического анализа.

Объект исследования — карбофуран (О-(2,3-дигидро-2,2-диметилбензофуранил-7)-N-метилкарбамат) фирмы «FMS Corporation» с содержанием основного вещества ≥99% (определено методом ГЖХ).

Рассматривали возможность применения системы растворителей этилацетат—ацетон (1:1) в качестве универсального изолирующего агента для извлечения карбофурана из тканей трупных органов и биожидкостей.

На модельных смесях карбофурана (размер частиц 5—50 мкм) с тканью «свежей» печени от трупа (размер частиц 0,2—0,5 см), которые сохранялись 24 ч при температуре 16—18 °С, исследовали зависимость степени извлечения анализируемого вещества из биоматериала с помощью рассматриваемой системы растворителей от кратности настаивания, его продолжительности, количественного соотношения изолирующего агента и биологической ткани. Определенное количество извлечения из каждой модельной смеси наносили на пластину Сорбфил UV-254 и хроматографировали, применяя подвижную фазу гексан—ацетон (6:4). На хроматограммах в УФ-свете наблюдали темное пятно карбофурана (Rf=0,64±0,03). Вещество элюировали из сорбента этанолом 15 мин. Оптическую плотность элюата измеряли при длине волны 278 нм на приборе СФ-56 в кювете с длиной оптического пути 10 мм на фоне контрольного раствора. Количество карбофурана в извлечении определяли, используя уравнение градуировочного графика.

Изучали особенности очистки карбофурана, выделенного из биоматериала, методом колоночной хроматографии [(колонка размером 490×11 мм, заполненная 10 г сорбента силикагеля КСС №3 80/120 мкм; элюент — система растворителей гексан—ацетон (8:2)]. Элюат собирали фракциями по 2 мл каждая. Карбофуран обнаруживали во фракциях методом ТСХ (пластины Сорбфил UV-254, подвижная фаза — гексан—ацетон (6:4), объем фракции, наносимый на пластину, 5—10 мкл).

Параллельно осуществляли контрольное хроматографирование на колонке извлечения из 25 г трупной печени человека. Фракции элюата, в которых теоретически возможно присутствие анализируемого вещества, объединяли, испаряли и растворяли остаток в 25 мл смеси гексан—диоксан—пропанол-2 (15:5:1). Далее измеряли оптическую плотность раствора при длине волны 278 нм (система растворителей и длина волны соответствуют условиям определения карбофурана методом ВЭЖХ).

Для предварительной идентификации карбофурана изучена возможность применения нормальнофазного и обращенно-фазного вариантов ТСХ. Вещество хроматографировали вместе с близкими по структуре соединениями на пластинах Сорбфил UV-254 и пластинах Сорбфил UV-254, обработанных 10% раствором вазелинового масла в гексане.

Для подтверждающей идентификации и количественного определения карбофурана применены методы УФ-спектрофотометрии, нормальнофазовой ВЭЖХ и ГХ МС.

При использовании метода ВЭЖХ хроматографировали на приборе Милихром с УФ-детектором в колонке размером 62×2 мм, заполненной гидроксилированным сорбентом Силасорб-600. В качестве подвижных фаз рассмотрен ряд малополярных и среднеполярных систем растворителей.

При определении карбофурана методом ГХ МС использовали хроматограф фирмы «Agilent Technologies» (США) модели 6890N с масс-селективным квадрупольным детектором модели 5973N. Хроматографировали в кварцевой капиллярной колонке DB-JMS (30 м×0,25 мм) с неподвижной фазой диметилполисилоксаном (толщина пленки фазы 0,25 мкм). Детектор работал в режиме электронного удара (70 эВ). Обнаружение вещества проводили в режиме регистрации по полному ионному току (диапазон сканирования 40—550 m/z).

Установлено, что для относительно полного извлечения вещества из трупной печени системой растворителей этилацетат—ацетон (1:1) необходимо как минимум двукратное настаивание биоматериала с изолирующим агентом при условии, что количество изолирующей жидкости в каждом случае превышает количество биоматериала как минимум в 2 раза по массе, а продолжительность каждого настаивания составляет не менее 30 мин.

При хроматографировании на колонке силикагеля КСС №3 80/120 мкм с применением подвижной фазы гексан—ацетон (8:2) анализируемое вещество обнаруживается во фракциях №7—13 (13—26 мл).

В опытах с тканью печени, не содержащей карбофурана, установлено, что фоновое поглощение раствора ¹/₄ сухого остатка фракций, в которых возможно присутствие данного вещества, в смеси гексан—диоксан—пропанол-2 (15:5:1) незначительно и не превышает 0,009 при 278 нм.

Результаты исследования хроматографической подвижности карбофурана в тонких слоях сорбентов представлены в табл. 1.

Как видно из данных табл. 1, оптимальными для хроматографирования данного вещества в тонком слое нормальнофазового сорбента следует считать подвижную фазу гексан—диоксан—пропанол-2 (15:5:1), для варианта обращенно-фазовой ТСХ — подвижную фазу ацетон—буфер (4:6) рН 8,95.

На электронных спектрах карбофурана в различных средах (трихлорметан, 95% этанол, ацетонитрил и 0,1 н. раствор хлороводородной кислоты) установлено присутствие выраженных полос поглощения в области 201—206 нм (ε=12236—13475), в области 217—220 нм (ε=2854—6992) и в области 278—281 нм (ε=1040—3363). В дальнейшем средой для определения карбофурана методом спектрофотометрии являлся 95% этанол.

Оптимальным для определения карбофурана методом ВЭЖХ явился элюент гексан—диоксан—пропанол-2 (15:5:1), подаваемый со скоростью 100 мкл/мин при температуре колонки 20 °С; аналитическая длина волны 278 нм, скорость движения диаграммной ленты 720 мм/ч, масштаб регистрации — 0,8 ед.о.п. Время удерживания составило 3,46 мин, коэффициент емкости — 1,21, число теоретических тарелок — 1731, фактор асимметрии пика — 0,94%. Открываемый минимум — 0,2 мкг в хроматографируемой пробе.

Градуировочный график имеет вид: S= 3,10458·C — 0,01061 (S — площадь пика, С — концентрация вещества в хроматографируемой пробе в микрограммах). Интервал линейности 0,02—1,60 мкг в хроматографируемой пробе.

При определении карбофурана методом ВЭЖХ в субстанции относительная ошибка среднего результата не превышала 1,4%.

На хроматограммах вещества, извлеченного из модельных смесей с биоматериалом по сравнению с хроматограммой стандарта не наблюдали дополнительных пиков и заметного увеличения фонового поглощения (рис. 1).

Для определения карбофурана методом ГХ МС предложены условия, при которых температура инжектора составляла 280 °С, температура интерфейса детектора 290 °С, начальная температура термостата колонки 200 °С, время при начальной температуре 5 мин, скорость нагрева термостата колонки 10 °С/мин, конечная температура термостата 280 °С, время при конечной температуре 10 мин. Газ-носитель — гелий, подаваемый со скоростью 28 см³/с. Ввод пробы в режиме без деления потока с задержкой 1 мин. В данных условиях на хроматограммах наблюдали пик (время удерживания 2,56 мин), соответствующий карбофурану. Масс-спектр вещества, соответствующий этому пику, включал сигналы ряда осколков (заряженных частиц) с характерными массами (m/z): 41 (2,97%), 57 (6,63%), 77 (6,56%), 91 (8,40%), 103 (6,29%), 122 (14,54%), 135 (3,93%), 149 (55,78%), 164 (100%), 221 (7,25%). Основным, масса которого принимается за 100%, являлся осколок массой 164 m/z.

Подобное сочетание сигналов характерных осколков вещества с временем удерживания позволяет с высокой степенью селективности идентифицировать анализируемое вещество методом ГХ МС. Открываемый минимум карбофурана составляет при этом 0,2·10^-9 г в хроматографируемой пробе.

Методика определения карбофурана в биологическом материале

Изолирование. 25 г биологического объекта, содержащего карбофуран, настаивали дважды по 30 мин с порциями системы растворителей ацетон—этилацетат (1:1) массой 50 г каждая при перемешивании. Объединенное извлечение пропускали через стеклянный фильтр диаметром 4 см со слоем безводного натрия сульфата толщиной 1,5—2,0 см, слой натрия сульфата промывали 20 мл изолирующего агента. Фильтраты объединяли, растворитель из объединенного фильтрата испаряли при комнатной температуре. Остаток растворяли в 2—3 мл ацетона, смешивали полученный раствор с 1,5 г силикагеля КСС №3 80/120 мкм и после испарения растворителя вносили данную смесь в хроматографическую колонку размером 490×10 мм, заполненную 8,5 г силикагеля КСС №3 80/120 мкм. Хроматографировали, используя элюент гексан—ацетон (8:2). Элюат собирали фракциями по 2 мл. Фракции с 7-й по 13-ю включительно объединяли, испаряли в токе воздуха при температуре 20—22 °С, остаток растворяли в 10 мл ацетона. В три выпарительные чашки (№1, №2, №3) вносили соответственно 0,1—2,0, 1—5 и 1,0—2,5 мл ацетонового раствора и испаряли растворитель.

Идентификация методом ТСХ. Остаток в чашке №1 растворяли в незначительном объеме ацетона и количественно наносили на линию старта хроматографической пластины Сорбфил UV-254. Хроматографировали, применяя элюент гексан—диоксан—пропанол-2 (15:5:1), в присутствии вещества-свидетеля. Хроматограммы детектировали в УФ-свете и идентифицировали анализируемое вещество по величине Rf, совпадающей с таковой вещества-свидетеля (0,51±0,02).

Идентификация методом УФ-спектрофотометрии. После хроматографирования методом ТСХ пятно вещества вырезали из хроматограммы, помещали в пробирку, элюировали вещество из сорбента 95% этанолом 15 мин и исследовали поглощение элюата в интервале длин волн 200—360 нм. Соединение идентифицировали по форме спектральной кривой и положению максимумов поглощения (206, 217 и 278 нм).

Идентификация методом ВЭЖХ. Остаток в чашке №2 растворяли в 5 мл диоксана, раствор переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл, туда же добавляли 1 мл пропанола-2 и доводили содержимое колбы до метки гексаном. Затем 2—16 мкл полученного раствора вводили в хроматограф. Хроматографировали по описанной ранее схеме. Анализируемое соединение идентифицировали по времени удержания.

Идентификация методом ГХ МС. Остаток в чашке №3 растворяли в 8—12 мл хлороформа, раствор переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили до метки хлороформом. Затем 2 мкл полученного раствора вводили в хроматограф фирмы «Agilent Technologies» (США) модели 6890N с масс-селективным квадрупольным детектором модели 5973N (фирма «Agilent Technologies») и хроматографировали в описанных ранее условиях.

Карбофуран идентифицировали по сочетанию времени удержания вещества в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре.

Количественное определение. По площади хроматографического пика, полученного на стадии идентификации методом ВЭЖХ, определяли количественное содержание анализируемого соединения, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывали на навеску анализируемого вещества, внесенную в биоматериал. Результаты представлены в табл. 2.

Согласно полученным данным, изменение содержания карбофурана в модельных смесях 1,25— 50 мг при постоянной массе навески биоматериала (25 г) сопровождается изменением среднего значения степени извлечения, не превышающим 1%.

Удается извлечь из модельных смесей с тканью печени 90,85—91,67%, с кровью 91,46—92,14%, с плазмой крови 92,62—93,39%, с мочой 91,38—91,79% соединения. Открываемый минимум данной методики (в 100 г биологического объекта) составляет: 0,5 мг вещества в печени, 0,4 мг в крови, 0,3 мг в плазме и 0,1 мг в моче.

Методику применили для идентификации и количественного определения карбофурана при проведении судебно-химической экспертизы случая отравления данным веществом.

Труп гр-ки Д. 1982 г. рождения обнаружен в собственной квартире. При вскрытии обнаружили в желудке и двенадцатиперстной кишке наличие красновато-фиолетовой жидкости без выраженного запаха, жидкое состояние крови, венозное полнокровие внутренних органов, разлитой характер трупных пятен. Для судебно-химического исследования доставили печень, почки, желудок и двенадцатиперстную кишку с содержимым, кровь, сердце, легкие. В результате исследования по предложенной схеме в органах трупа и крови обнаружен и идентифицирован карбофуран.

Получили УФ-спектры в этаноле стандарта карбофурана и карбофурана, извлеченного из трупного материала (рис. 2).

По хроматограмме и масс-спектру карбофурана, выделенного из трупной печени, и масс-спектру стандарта карбофурана обнаружили совпадение масс-спектров анализируемого и стандартного веществ на 86% (рис. 3).

Количественная оценка содержания карбофурана в трупном материале приведена в табл. 3.

Как видно из данных табл. 3, наибольшее количество вещества находилось в желудке с содержимым, двенадцатиперстной кишке с содержимым и печени, меньше — в других органах.

Таким образом, разработанная методика может быть применена при экспертизе случаев отравления карбофураном.

1. Показана возможность и определены оптимальные условия изолирования карбофурана из биологического материала системой растворителей этилацетат—ацетон (1:1).

2. Разработана универсальная методика определения карбофурана в тканях трупных органов и биожидкостях на основе изолирования рассматриваемой смесью растворителей и очистки в колонке силикагеля.

3. Для идентификации и оценки количественного содержания исследуемого вещества в биологических объектах предложены ТСХ, электронная спектрофотометрия, ВЭЖХ и ГХ МС.

4. Показана возможность применения разработанной методики для исследования экспертного материала.