Сегодня ведется активный поиск маркеров пародонтита, которые позволили бы выявлять пациентов группы риска задолго до появления первых признаков этого заболевания, прогнозировать течение болезни и своевременно проводить профилактические/лечебные мероприятия [1].

Особенностью агрессивных форм пародонтита нередко является несоответствие между значительной деструкцией кости альвеолярного отростка челюстей и отсутствием в тканях десны признаков активного воспалительного процесса. Среди возможных причин развития агрессивных форм пародонтита рассматривают изменения экспрессии образраспознающих рецепторов (pattern recognition receptors — PRR), вовлеченных в распознавание микроорганизмов с последующей инициацией иммунного ответа в тканях пародонта, и (или) мутации в одном или нескольких генах, кодирующих эти рецепторы [2—4].

Экспрессия PRR выявлена не только во всех клетках врожденного иммунитета (моноцитах/макрофагах, дендритных клетках, нейтрофилах, тучных клетках, естественных киллерах), но и в различных популяциях Т-лимфоцитов, фибробластах, остеобластах и многослойном плоском эпителии, что говорит о существенной роли этих рецепторов в регуляции иммунных реакций организма [5].

NOD-подобные рецепторы (NLR) относятся к семейству цитоплазматических PRR. Располагаясь в цитозоле, они воспринимают проникшие в клетку микроб-ассоциированные молекулярные паттерны — консервативные структуры патогенов и комменсалов. Данное семейство включает 23 рецептора, объединенных общей структурой NOD (nucleotid-binding oligomerization domain). Стимуляция NLR микробными паттернами запускает продукцию прововоспалительных и противовоспалительных цитокинов, α- и β-дефензинов, оказывающих противомикробное действие, и хемокинов, привлекающих клетки иммунной системы в очаг вторжения микроорганизмов, а также потенцирует адаптивные иммунные реакции [5].

При воспалительных процессах в тканях пародонта через эти сенсоры a priori могут передаваться как флогогенные, так и саногенетические сигналы, интенсивность и баланс которых определяются не только цитоплазматическими концентрациями лигандов этих рецепторов, но и степенью экспрессии последних.

Вместе с тем информация об особенностях экспрессии NLR при пародонтите весьма противоречива и сфокусирована главным образом на одном их них — NLRP3 [6]. Уточнение закономерностей изменения экспрессии этого и других NLR в тканях пародонта при прогрессировании заболевания и на фоне проводимого лечения могло бы послужить основой для разработки методов ранней диагностики/прогноза развития агрессивных форм пародонтита, а также таргетной терапии этого заболевания.

Цель исследования — изучение экспрессии NLR в тканях пародонта пациентов с агрессивной формой пародонтита до и после проведения комплексного лечения.

Материалы и методы

Обследовали 15 пациентов с агрессивной формой пародонтита до лечения и через 21 день после начала проведения комплексного лечения; 15 пациентов с фибромами слизистой оболочки десны без признаков воспаления служили контролем. Средний возраст пациентов составил 35 лет, диапазон — от 22 до 36 лет.

Пациентам с агрессивной формой пародонтита снимали зубные отложения с помощью ультразвуковых приборов Piezon Master 250 и полировали поверхности корней зубов пародонтальными борами по методике Scaling & Root Planning, по показаниям проводили антибактериальную терапию, местное противовоспалительное лечение, а также обучали правилам гигиены рта с последующим трехкратным контролем. В течение первой недели контроль гигиены осуществляли 1 раз в 3 дня, затем — 1 раз в неделю.

В процессе лечения проводили кюретаж пародонтальных карманов. Из грануляционной ткани, удаленной из пародонтальных карманов, готовили гистологические препараты и проводили иммуногистохимический анализ экспрессии NLR у пациентов до лечения и через 21 день после начала комплексного лечения с использованием кроличьих и мышиных антител к этим рецепторам (табл. 1). Экспрессию NLR изучали также в образцах слизистой оболочки десны контрольной группы.

Таблица 1. Антитела к различным типам NOD-рецепторов в тканях пародонта

Для иммуногистохимического исследования биопсийного материала из блоков, приготовленных для гистологического исследования, на микротоме нарезали серийные срезы толщиной 5 мкм и монтировали на стекла, покрытые поли-L-лизином. Иммуногистохимическое исследование проводилось согласно стандартному протоколу «ПраймБиоМед» (Россия) с использованием универсальной системы детекции: энхансер, поли-HRP-конъюгат, субстрат + хромоген DAB. Полученный материал оценивался с помощью микроскопа Axioplan 2 Imaging (Karl Zeiss, Германия); для фотографирования препаратов использовалась камера AxioCam ERc5s (Karl Zeiss, Германия).

Экспрессию NLR оценивали по степени интенсивности окрашивания тканей в баллах (от 0 до 4) и выявляли распределение этих рецепторов в ядрах и цитоплазме многослойного плоского эпителия и клетках воспалительного инфильтрата субэпителиальных тканей пародонтального кармана.

Для сравнения связанных выборок применяли критерий Уилкоксона, независимых выборок — критерий Манна—Уитни. Выдвигалась нулевая гипотеза об отсутствии статистически значимых различий между показателями сравниваемых выборок, которую отвергали при уровне значимости p<0,05. При 0,1>p≥0,05 констатировали математически подтвержденную тенденцию.

Результаты и обсуждение

В многослойном плоском ороговевающем эпителии образцов слизистой оболочки десны пациентов с фибромами десны без признаков воспаления, служивших контрольной группой, не удалось выявить экспрессию ни одного из изученных NLR (табл. 2).

Таблица 2. Интенсивность экспрессии NLR в слизистой оболочке десны больных фибромой без признаков воспаления и в тканях пародонта пациентов с агрессивным пародонтитом до и после комплексного лечения по данным иммуногистохимического анализа

Примечание. Значимость различий с контролем: * — p<0,05. Значимость различий с показателями до лечения: ^# — 0,1>p≥0,05 (математически подтвержденная тенденция); ^## — 0,05>p≥0,01; ^### — p<0,01.

Выраженная экспрессия NOD1, NLRP3, NLRP12 и NAIP обнаружена в ядрах и цитоплазме клеток многослойного плоского неороговевающего эпителия пародонтального кармана и клетках хронического воспалительного инфильтрата в субэпителиальных тканях пародонтального кармана у всех пациентов с обострением агрессивной формы пародонтита. Установлена высокая степень внутриядерной локализации указанных NLR в эпителиоцитах пародонтальных тканей. Высокая плотность этих рецепторов выявлена и в клетках хронического воспалительного инфильтрата субэпителиальных тканей пародонтального кармана. NLRP3 был наиболее интенсивно экспрессируемым из изученных рецепторов.

Кроме того, у всех пациентов в клетках воспалительного инфильтрата выявлена экспрессия NLRP7, тогда как в ядрах и цитоплазме эпителия пародонтального кармана этот рецептор обнаружили лишь у единичных (у 2 из 15) пациентов.

В клетках воспалительного инфильтрата иммуногистохимически выявляли NLRC3 у подавляющего большинства (у 13 из 15) пациентов, а в ядрах и цитоплазме эпителиоцитов — меньше чем у половины пациентов с обострением пародонтита (у 6 из 15 и у 4 из 15 соответственно).

Экспрессия NOD2 выявлена у 9 из 15 пациентов в острую фазу заболевания в клетках воспалительного инфильтрата и не выявлена ни у одного из пациентов в эпителиоцитах пародонтального кармана.

В результате комплексного лечения пациентов с агрессивной формой пародонтита через 3 нед происходило статистически значимое снижение экспрессии всех NLR в клетках воспалительного инфильтрата, за исключением NLRC3, экспрессия которого оставалась на прежнем уровне (см. табл. 2).

Лечение приводило к существенному уменьшению экспрессии NLRP3, NLRP7 и NAIP в ядрах эпителиоцитов пародонтального кармана. Также выявлена тенденция к снижению внутриядерного содержания NOD1 и NLRC3, а экспрессия NLRP12 в ядрах эпителиальных клеток практически не изменялась.

На фоне терапии статистически значимо уменьшалась экспрессия NLRP3, NLRP12 и NAIP в цитоплазме эпителиоцитов пародонтального кармана. Кроме того, обнаружено полное исчезновение цитоплазматически локализованного NLRC3 у всех пациентов, у которых этот рецептор был исходно выявлен в этом компартменте эпителиальных клеток, что позволило констатировать математически подтвержденную тенденцию к снижению экспрессии NLRC3 в выборке в целом. Экспрессия NOD1 в цитоплазме эпителиоцитов существенно не отличалась от таковой до лечения.

Экспрессию NOD2 как в ядрах, так и в цитозоле эпителиальных клеток пародонтального кармана после лечения, как и до его проведения, не выявили.

В зависимости от структурной организации эффекторных N-терминальных доменов NLR подразделяют на четыре подсемейства: NLRP, NLRC, NLRB (NAIP) и NLRA. Настоящее исследование было сфокусировано на экспрессию представителей первых трех подсемейств в пародонтальных тканях пациентов с агрессивным пародонтитом.

Интересные данные получены в отношении экспрессии рецепторов NLRP-подсемейства, содержащих пириновый (PYR) домен. Нами установлена самая высокая экспрессия NLRP3 среди всех изученных NLR в тканях пародонта пациентов с пародонтитом и ее прямая зависимость от выраженности клинических проявлений заболевания, что согласуется с данными других научных групп [6]. Недавно было установлено, что не только уровень экспрессии этого рецептора в пораженных тканях, но и его концентрация в слюне и сыворотке может отражать наличие/тяжесть пародонтита [7, 8]. Известно, что NLRP3 как основной компонент NLRP3-инфламмасом участвует в активации каспаз, обеспечивающих внутриклеточный процессинг и образование зрелых форм провоспалительных цитокинов: интерлейкина (ИЛ)-1β и ИЛ-18. Экспрессия NLRP3 и других белков NLRP3-инфламмасом усиливается под влиянием сигналов, опосредованных MAMP и молекулярными паттернами, связанными с повреждением (damage-associated molecular patterns — DAMP). В этой связи NLRP3-инфламмасомы привлекают пристальное внимание ученых как потенциальная мишень таргетных воздействий с использованием низкомолекулярных соединений и биологических препаратов для лечения целого ряда воспалительных заболеваний [9]. Полученные нами данные говорят о том, что этот ряд может быть пополнен пародонтитом.

В эпителиальных клетках пародонтального кармана нами выявлена лишь следовая экспрессия другого представителя NLRP-подсемейства, NLRP7, через который проводятся не только провоспалительные, но и толерогенные (противовоспалительные) сигналы, в том числе регулирующие (подавляющие) NLRP3-опосредованные реакции [10]. Низкая экспрессия NLRP7 в пародонтальных тканях может быть одним из факторов избыточности NLRP3-зависимых (а возможно, и других) флогогенных каскадов при агрессивном пародонтите.

Выявлены и особенности экспрессии еще одного рецептора, NLRP12, участвующего в подавлении воспалительных реакций. Вероятно, его выраженная экспрессия и в эпителии, и в клетках воспалительного инфильтрата пародонтальных тканей при обострении пародонтита отражает защитно-приспособительные (толерогенные) реакции организма. Вместе с тем сохранение высокого внутриядерного содержания NLRP12 после проведенного лечения может обусловливать недостаточность противоинфекционной защиты, связанную в том числе с подавлением адаптивного иммунного ответа [10].

NOD1 и NOD2, содержащие CARD-домен представители NLR-подсемейства NLRC (NOD), представляют собой «центральных игроков» в инициации и одновременно контроле иммунных реакций и воспаления в ответ на компоненты клеточной стенки бактерий [9, 10]. Оба рецептора проводят как прововоспалительные, так и противовоспалительные сигналы в зависимости от исходного функционального состояния клеток и их микроокружения [11].

Данные научной литературы о роли NOD1 при пародонтите противоречивы [11—14]. На модели пародонтита у мышей установлено защитное значение NOD1-сигналов в контексте воспаления пародонтальных тканей и потери альвеолярной кости [12]. Противоположные результаты были получены на другой мышиной модели, в условиях которой нокаут гена NOD1 делал животных менее восприимчивыми к пародонтиту, что свидетельствует о флогогенной роли NOD1-сигналов, способствующих привлечению нейтрофилов и остеокластов к альвеолярной кости [15]. Еще в одной работе выявлена выраженная экспрессия этого рецептора в клетках воспаленной субэпителиальной соединительной ткани пародонта (что согласуется с нашими данными) и установлено, что NOD1-опосредованные сигналы усугубляют потерю альвеолярной костной ткани за счет снижения остеогенного потенциала стволовых клеток пародонтальной связки человека [16]. Обнаруженная нами высокая и достаточно стойкая экспрессия этого рецептора в пародонтальных тканях пациентов с агрессивным пародонтитом не проясняет биологического значения этого факта, но вместе с тем свидетельствует о потенциале таргетных воздействий на NOD1 в контексте регуляции ответных реакций организма на пародонтопатогены.

NOD2 выделялся среди других изученных рецепторов подсемейства NLRC тем, что его экспрессия в эпителиоцитах пародонтального кармана была ниже уровня детекции использованного метода иммуногистохимического анализа у всех обследованных больных пародонтитом. Ранее на модели пародонтита in vivo установлено неоднозначное действие NOD2-сигналов в тканях пародонта: с одной стороны, такие сигналы подавляли резорбцию кости альвеолярного отростка, с другой — потенцировали выработку провоспалительных медиаторов [17]. Вероятно, выявленная нами недостаточная экспрессия NOD2 в эпителиоцитах пародонтального кармана обусловливает неэффективность врожденного иммунного ответа на пародонтопатогены и создает условия для прогрессирования резорбции кости при агрессивном пародонтите.

Для NLRC3, третьего представителя NLRC-подсемейства, установлены в целом те же закономерности экспрессии в пародонтальных тканях, что и для NOD2.

В значительной степени пионерскими представляются данные о высокой экспрессии NAIP, содержащего BIR-домен представителя NLRB-подсемейства NLR, в ядрах и цитоплазме эпителиоцитов и клетках субэпителиального воспалительного инфильтрата пародонтального кармана. Известно, что этот многофункциональный рецептор, через которой проводятся как провоспалительные, так и анти-апоптотические сигналы, экспрессируется в разных тканях, таких как печень, легкие и селезенка, что, скорее всего, связано с инфильтрацией макрофагами [18]. Однако его экспрессия в воспаленных тканях пародонта ранее не описана. Снижение содержания NAIP и ряда других изученных NLR в результате проведенного лечения говорит о том, что уровень их экспрессии в пародонтальных тканях может являться маркером не только тяжести заболевания, но и эффективности лечебных воздействий при агрессивном пародонтите.

Заключение

Полученные данные модернизируют представления о характере экспрессии NLR в тканях пародонта у больных агрессивным пародонтитом, что открывает новые возможности для совершенствования диагностики, прогноза течения и таргетной терапии этого заболевания. Для прояснения биологического (флогогенного или саногенетического) значения изменений экспрессии этих рецепторов при обострении агрессивного пародонтита и в ходе лечения этого заболевания требуются дополнительные исследования.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.