Введение

Диагностика и лечение болезней пульпы остается одной из ведущих проблем в стоматологии, что определяется высокой распространенностью данной патологии среди населения [1]. В общей структуре оказания медицинской помощи больным в лечебно-профилактических учреждениях стоматологического профиля воспаление пульпы зуба встречается во всех возрастных группах пациентов в 28—30% от общего числа обращений [2, 3]. Клиницисты зачастую сталкиваются с дилеммой при лечении витальных зубов с глубоким кариозным поражением и развитием в тканях пульпы обратимого воспаления: следует ли проводить малоинвазивное лечение с целью поддержания жизнеспособности пульпы или выполнять витальную экстирпацию для предотвращения некроза пульпы, ее дальнейшего инфицирования и профилактики апикального периодонтита [4]. Однако ввиду того что существующие методы диагностики ограничены определением косвенных признаков воспаления, не предоставляется возможным провести достоверную дифференциальную диагностику обратимости воспаления в пульпе. Это особенно важный этап, который предопределяет дальнейший план лечения и, в частности, возможность сохранения жизнеспособности пульпы [5, 6].

Для диагностики состояния пульпы более предпочтительны неинвазивные или малоинвазивные методы обследования, которые позволяют осуществлять контроль эффективности лечения и мониторинг статуса витальности пульпы без ее повреждения [7]. Один из таких методов — исследование дентинной жидкости зуба (ДЖЗ), поскольку оно позволяет без специальной подготовки пациента к исследованию и с минимальным риском для здоровья оценить активность воспалительного процесса в пульпе зуба [8, 9].

ДЖЗ является транссудатом периферических сосудов пульпы, поэтому может содержать те же клетки иммунного ответа, что и пульпа, в том числе маркеры воспаления, которые служат достоверным источником информации о степени воспаления внутри пульпарной полости [10]. В процессе развития воспаления в пульпе участвует множество сигнальных молекул, концентрация которых меняется в зависимости от стадии воспаления [6—8].

Однако одна из основных проблем данного диагностического подхода состоит в чрезвычайно малом объеме выхода ДЗЖ на поверхность обнаженного дентина витальных зубов [8, 11]. Таким образом, для решения данной проблемы было проведено настоящее клинико-экспериментальное исследование, направленное на поиск наиболее эффективного метода стимуляции скорости тока ДЖЗ в область обнаженного дентина и оптимального средства для забора биологического образца с целью последующего высокотехнологического анализа, для которого требуется определенная концентрация белка в исследуемых образцах.

Цель исследования — определение наиболее эффективной методики стимуляции и забора ДЗЖ.

Материал и методы

Дизайн клинико-экспериментального исследования состоял из двух последовательных этапов: 1 — поиск адаптивного инструмента для забора ДЗЖ; 2 — сравнительный анализ различных методов стимуляции скорости тока жидкости в область обнаженного дентина.

Инструменты для забора ДЗЖ. Для забора ДЗЖ были апробированы 3 вида фильтровальных дисков отечественного производителя ООО «Технофильтр» (Владимир, Россия) и фильтровальная мембрана для блоттинга из нитроцеллюлозы Sartorius 1288 («Stedim Biotech GmbH», Геттинген, Германия):

— мембраны микропористые капроновые марки ММК, размер пор 0,45 мкм («Технофильтр», Россия);

— мембраны микрофильтрационные полиэфирсульфоновые марки МПС, размер пор 0,45 мкм («Технофильтр», Россия);

— микрофильтрационные гидрофильные фторопластовые мембраны марки МФФ2-0,45, размер пор 0,45 мкм, общая пористость 80—85%; известны как PVDF мембрана («Технофильтр», Россия);

— фильтровальная бумага из а-целлюлозы класса 1288 («Sartorius Stedim Biotech GmbH», Германия) плотностью 84 г/м², толщиной 0,21 мм и задерживающей способностью 12—15 мкм.

В целях стандартизации параметров исследования размер используемых мембран составлял 0,7×1,5 см. Были подготовлены 40 проб ДЗЖ, забор которых осуществляли с помощью исследуемых 4 видов мембран (n=10). Методика забора проб ДЗЖ подразумевала внесение в сформированную полость зуба мембраны, которую адаптировали к стенкам полости и оставляли на 2 мин (рис. 1). Затем мембраны помещали в пробирку Эппендорфа с 0,5 мл D₂O (тяжелая вода) и замораживали в жидком азоте при температуре –196 °C до проведения дальнейших исследований.

Рис. 1. Забор пробы дентинной жидкости зуба с помощью адсорбирующей мембраны.

а — сформированная полость зуба после препарирования; б — адсорбирующая мембрана на дне сформированной полости зуба.

Оценку эффективности адсорбирующей способности исследуемых мембран проводили по величине сигналов накопления органических молекул ДЗЖ в полученных образцах методом протонного магнитного резонанса (ЯМР-спектроскопия). Для проведения ЯМР ¹H-спектрометрии высокого разрешения после дефростации проб ДЗЖ переносили в калиброванные ЯМР-ампулы с внешним диаметром 5 мм. Затем ЯМР-ампулы помещали в датчик ЯМР-спектрометра высокого разрешения Bruker AVANCE-300. Запись спектров ЯМР ¹H осуществлялась по стандартной одноимпульсной программе [12].

Методы стимуляции скорости тока ДЗЖ. При проведении клинических испытаний мембранные фильтры подвергали предварительному автоклавированию при температуре 134 °C, давлении 2 бар и экспозиции 20 мин. В исследование было включено 30 постоянных зубов с диагнозом К04.00 «Начальный пульпит», которые были случайным образом распределены на 5 групп (n=6) в соответствии с применяемым методом стимуляции скорости тока ДЖЗ: 1-я группа — метод дегидратации струей холодного воздуха; 2-я группа — метод дегидратации 10% раствором кальция хлорида; 3-я группа — метод дегидратации 20% раствором глюкозы; 4-я группа — метод дегидратации 10% раствором (гипертоническим) натрия хлорида; 5-я группа — метод дегидратации 10% раствором декстрана.

У всех пациентов определяли объем полученной ДЗЖ на контрольном (до стимуляции) и экспериментальном (после стимуляции) этапах исследования путем взвешивания мембраны после сбора биологического материала с помощью лабораторных электронных аналитических весов Adventurer RV214 (210 г/0,1 мг; «OHAUS Europe», Швейцария). В качестве контроля исследования забор образцов ДЗЖ осуществляли в стандартных условиях без применения стимулирующих методов. Чтобы избежать потенциальной кластеризации данных, только 1 зуб у каждого пациента был включен в данный эксперимент.

Стимуляцию скорости тока ДЗЖ осуществляли в течение 10 с при использовании направленной струи холодного воздуха из стоматологического пустера; гиперосмотические и гипертонические растворы вносили в полость зуба с помощью ватного шарика и оставляли в полости зуба в течение 2 мин. Рассчитанная планируемая численность выборки эксперимента обеспечивает приемлемый уровень статистической мощности (≥80%) на минимальном уровне выборки, равной 6 пациентам в каждой группе.

Исследование одобрено локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения РФ.

Для статистической обработки полученных данных использовали программное обеспечение IBM SPSS Statistics 26 и Jamovi 1.1.9. На основании непараметрического парного теста Вилкоксона рассчитывали вероятность различия p внутри каждой группы и непараметрического аналога дисперсионного анализа — теста Крускала—Уоллиса — между исследуемыми группами. Достоверными считали данные, для которых вероятность (p) ошибки была меньше 0,05.

Результаты и обсуждение

Согласно результатам ЯМР-спектроскопии диапазон химических сдвигов в пробах с применением целлюлозной мембраны Sartorius 1288 достоверно отличался от результатов в группах сравнения (P<0,05), а также была детерминирована наибольшая сила сигналов, которая менялась от +0,8 до +4,0 ppm и соответствовала органическим группам CH₃, CH₂ и CH (рис. 2). Слабые сигналы ¹H отмечены для всех проб ДЗЖ, полученных с помощью мембран фирмы «Технофильтр», что свидетельствовало об их низкой адсорбирующей способности органических групп из ДЗЖ (рис. 3).

Рис. 2. Спектр ЯМР ¹H с увеличенной амплитудой сигнала в пробах дентинной жидкости зубов с использованием мембраны Sartorius 1288.

Рис. 3. Спектр ЯМР ¹H со слабым сигналом в пробах дентинной жидкости зубов с использованием мембран «Технофильтр».

В каждом из экспериментов №1—5 были произведены 12 измерений веса используемых мембран Sartorius 1288 в контрольной серии проб до применения стимуляции (n=6) и в экспериментальной серии проб после стимуляции (n=6). На основании того, что для каждого проведенного эксперимента (№1—5) двусторонний уровень значимости достигает 0,03<0,05, нулевая гипотеза (медиана разностей веса мембраны в контрольном и экспериментальном пробах равна нулю) отвергнута на уровне значимости 0,05 (табл. 1). Таким образом, в каждом из указанных экспериментов вес мембран в экспериментальных сериях отличается от веса мембран в контрольных сериях с вероятностью 95%.

Таблица 1. Результаты взвешивания мембран после применения различных методов стимуляции в экспериментах №1—5

Примечание. W — значения критерия Вилкоксона для контрольных и экспериментальных проб внутри групп; * — различия статистически значимы.

В табл. 2 приведены результаты попарного сравнения измерений веса мембран серий экспериментальных проб каждого из экспериментов, а также статистически значимые различия веса мембран после стимуляции скорости тока ДЖЗ различными методами между 5 группами на основании непараметрического теста Крускала—Уоллиса (p<0,05).

Результаты, представленные в табл. 2, позволяют отклонить нулевую гипотезу об отсутствии статистически значимых различий веса мембран в экспериментальных сериях проб после применения изучаемых методов стимуляции скорости тока ДЖЗ на уровне значимости 0,05. Следовательно, можно сделать вывод, что наиболее эффективным способом стимуляции скорости тока ДЖЗ является метод дегидратации с использованием 10% раствора декстрана. При этом эффективность процедуры забора ДЖЗ в случае применения данного метода возрастает в 2 раза в сравнении с забором проб ДЖЗ при естественных условиях. На основании проведенных исследований был получен патент на изобретение №2737492 «Способ забора дентинной жидкости зуба».

Таблица 2. Результаты попарных сравнений веса мембран экспериментальных проб между группами

Примечание. * — различия между группами статистически значимы.

Суть предложенного метода заключается в том, что после препарирования зуба стерильными борами дентин дна и стенок полости зуба протравливают 37% ортофосфорной кислотой в течение 10 с, затем полость промывают дистиллированной водой из пустера. В полость зуба вносят ватный шарик, обильно смоченный гиперосмотическим раствором 10% низкомолекулярного декстрана, и оставляют на 2 мин. Затем в полость вносят целлюлозную мембрану размером 0,7×1,5 см на 2 мин с целью адсорбции ДЗЖ. В заранее подготовленную пробирку Эппендорфа с 0,5 изотоническим раствором натрия хлорида переносят используемую мембрану с образцами биологического материала и замораживают при температуре –200 °C до последующего исследования.

Сообщалось, что обнажение трубочек при переломе зуба или во время препарирования высушивание поверхности дентина холодным сжатым воздухом полости часто приводит к движению жидкости в область открытой поверхности дентина, где она появляется в виде мельчайших капель [9]. Однако одной из основных проблем данного метода диагностики является чрезвычайно малый объем выхода ДЗЖ на поверхность обнаженного дентина витальных зубов. Количество экссудата дентинных канальцев, который можно собрать после препарирования дентина, недостаточен для всестороннего молекулярного анализа сигнальных молекул воспаления [6].

Для решения данной проблемы предложен метод стимуляции движения жидкости кнаружи в область обнаженного дентина, который базируется на фундаментальных принципах осмолярности. Благодаря осмотическому давлению, которое искусственно создается за счет внесения в полость зуба гиперосмотического раствора, растворитель стремится к понижению концентрации более концентрированного раствора вследствие встречной диффузии молекул растворенного вещества и растворителя. В данной системе в качестве растворителя выступает дентинная жидкость, а концентрированной жидкостью является гиперосмотический раствор. Осмотическое давление зависит от концентрации осмотически активных веществ (электролитов, неэлектролитов, белков) в растворе. Таким образом, чем выше концентрация подлежащего опреснению раствора, тем выше градиент концентрации и перепад осмотических давлений и тем активнее диффузия. Поскольку дентинная жидкость богата белковыми структурами, это дополнительно создает коллоидно-осмотическое давление. С учетом градиента осмотической концентрации и ионной заряженности раствора для стимуляции тока дентинной жидкости кнаружи в область свежесрезанного дентина в качестве гиперосмотического раствора был выбран Декстран — 10% коллоидный раствор со средней молекулярной массой 35 000—45 000 Da, который вызывает ускорение восходящего потока жидкости, обусловленного капиллярным поднятием. Это увеличивает скорость выхода необходимого объема дентинной жидкости на поверхность дна сформированной полости в 2 раза за единицу времени. Таким образом, движение дентинной жидкости достигается за счет сочетанного действия капиллярности транспортных структур, коллоидно-осмотического и тканевого (внутрипульпарного) давления.

Кроме того что в ходе исследования была выявлена необходимость предварительного протравливания поверхности дентина 37% ортофосфорной кислотой в течение 5 с перед стимуляцией. Данная процедура позволяет очистить дентинные трубочки от дебриса и смазанного слоя после препарирования, что дополнительно открывает отверстия дентинных трубочек, усиливает эффект стимуляции и выход дентинной жидкости на поверхность обнаженного дентина.

Следует отметить, что оценка стадии воспалительного процесса на молекулярном уровне является относительно новым подходом, который позволит усовершенствовать диагностику и лечение начальных форм пульпита.

Заключение

На основании проведенного клинико-экспериментального исследования выявлено, что оптимальным и наиболее эффективным методом забора дентинной жидкости зуба является применение нитроцеллюлозной мембраны при осмотической концепции стимуляции тока дентинной жидкости с помощью 10% раствора декстрана, который увеличивает скорость тока жидкости в 2 раза за единицу времени. Предложенный способ забора дентинной жидкости является малоинвазивным, что позволяет получать необходимый для высокотехнологичного анализа объем дентинной жидкости в короткий срок при сохранении витальности пульпы. Кроме того, этот способ прост в исполнении и соответствует малоинвазивному подходу в стоматологии, поэтому может быть использован как в практическом здравоохранении, так и при проведении дальнейших научно-практических исследований.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interests.