Микробные биопленки, формируемые стрептококками, оральными анаэробами и дрожжевыми грибами на слизистой оболочке и полимерных зубных протезах, играют ключевую роль в развитии стоматита, который является одной из наиболее часто встречающихся патологий в стоматологической практике.

Протезный стоматит — одно из наиболее распространенных заболеваний полости рта у пожилых людей, которое встречается и в молодом возрасте. Хотя доступ к стоматологической помощи за последние десятилетия улучшился, распространенность стоматита по данным ряда авторов остается на высоком уровне и составляет 60—70% среди осложнений при протезировании даже в развитых странах [1].

Клинически протезный стоматит может проявляться в разных формах — от легкого, локализованного воспаления до ярко выраженной папиллярной гиперплазии слизистой оболочки, что особенно характерно для кандидозной этиологии процесса. Этиология кандидоза слизистой оболочки полости рта многофакторна, но обычно связана с хронической травмой из-за протеза и присоединяющейся инфекцией. Факторы риска включают системные заболевания (диффузные заболевания соединительной ткани), иммунодефициты, снижение слюноотделения (ксеростомия), превышение допустимого времени для использования полимерных протезов, побочные эффекты применения определенных лекарственных препаратов (особенно кортикостероидов и цитостатиков), курение сигарет и плохую гигиену рта [1—3].

Одной из наиболее частых причин стоматита является активизация дрожжевых грибов Candida albicans. Дрожжевые грибы Candida формируют биопленки на разнообразных биоматериалах и часто присутствуют на поверхности зубных протезов, в том числе полимерных [4, 5]. Состояние характеризуется воспалением слизистой оболочки краевого пародонта, причем заболевание протекает длительно, хронически, нередко сопровождаясь развитием устойчивости к противогрибковым препаратам. В последние годы все больше сообщений о том, что биопленки C. albicans обладают высокой устойчивостью к полиеновым антибиотикам и азолам, включая новейшие препараты этого класса, вориконазол и позаконазол. Клетки, живущие в биопленках, в 1000 раз более устойчивы к флуконазолу, чем планктонные клетки, а триазолы на 50% менее эффективны в отношении C. albicans, которые населяют биопленки по сравнению с их свободными живыми бластоспорами [6—9].

В микробиологических исследованиях, проведенных в последние годы в нашей стране и за рубежом, показано, что биопленка, формируемая грибами, быстро колонизируется представителями бактериальной микробиоты — стрептококками, энтерококками, лактобациллами, анаэробами, многие из которых обладают высоким патогенным потенциалом [2, 3, 10].

В любом случае биопленка представляет собой сложный многовидовой консорциум, который играет важную роль в развитии патологии слизистой оболочки рта. Поэтому вопрос оценки микробной адгезии как первого этапа формирования биопленки, представителей этих таксономических групп к стоматологическим полимерным материалам для изготовления временных протезов и зубных шин, несомненно, представляет актуальность.

Ввиду того что микробные биопленки обладают высокой устойчивостью к индивидуальным гигиеническим процедурам (чистке зубов), применению антисептиков и антибиотиков, безусловно, необходимы новые стратегии в изучении и оценке процессов адгезии оральной микробиоты на поверхности протезов, особенно полимерных, с учетом видового разнообразия и характеристик стоматологического конструкционного материала.

Цель исследования — характеристика адгезии дрожжевых грибов и оральных бактерий разных видов in vitro к образцам полимерных материалов для несъемных конструкций зубных протезов, созданных с помощью инновационных цифровых аддитивных технологий 3D-печати и традиционными методами.

Материал и методы

Во всех случаях бактериальной или грибковой колонизации принципиальное значение имеет фактор изменения микроэкологии полости рта, который является следствием использования того или иного стоматологического конструкционного материала, его химического состава, особенностей полимеризации, технологии создания протеза, чистоты поверхности и т.п. Поэтому в настоящем исследовании мы проводили сравнение степени адгезии микробов как начального этапа формирования биопленки к образцам полимерных материалов, полученных с помощью стоматологических цифровых аддитивных технологий 3D-печати и традиционными методами.

Материал

1) акриловые полимерные материалы применяемы в 3D-печати:

— NextDent C&B Micro Filled Hybrid («NextDent», Нидерланды);

— Detax Freeprint temp UV («Detax», Германия).

2) БИС-акриловые полимерные материалы в качестве контроля:

— Luxatemp Automix Plus («DMG», Германия);

— Acrytemp («Zhermack», Италия).

Штаммы:

1) пигментообразующие бактероиды — грамотрицательные, облигатно-анаэробные бактерии — Prevotella intermedia, Porphyromonas gingivalis;

2) грамотрицательные анаэробные и микроаэрофильные бактерии — Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Fusobacterium periodonticum;

3) грамположительные анаэробные и микроаэрофильные бактерии — Аctinomyces naeslundii, Streptococcus intermedius, S. sanguinis, Staphylococcus anaerobius;

4) дрожжевые грибы — Candida albicans.

Перечисленные виды бактериальной микробиоты, за исключением S. sanguinis и S. anaerobius, относят к пародонтопатогенным видам 1-го или 2-го порядка. Дрожжевые грибы рода Candida, по-видимому, играют роль при наличии генетической предрасположенности и развитии определенных дефектов иммунной системы. Представители стабилизирующих видов, поддерживающих нормальный количественный и качественный состав микробной флоры десневого желобка (S. sanguinis), при развитии патологии тоже могут быть фактором, осложняющим течение при сопутствующей патологии и микроэкологических условиях [4, 5, 11—13].

Методика эксперимента. Исследование первичной адгезии осуществлялось в соответствии с общепринятым алгоритмом [14], для осуществления которого мы изготавливали образцы в виде таблеток диаметром 5 мм и толщиной 1 мм (рис. 1).

Образцы материалов (по 5 штук каждого вида) предварительно были отполированы с помощью соответствующих полировочных дисков и паст и образцы (также по 5 штук) с поверхностью, полученной после 3D-печати, без дополнительной обработки. Образцы материалов помещали в пробирку со средой АС, содержащей бактерии определенного вида (штамма) в известной концентрации (10⁸ КОЕ/мл для бактерий и 10⁶ для грибов) с целью моделирования процесса адгезии.

Для создания стерильных условий на поверхности образцов их обрабатывали 70% спиртом и помещали в стерильные чашки Петри непосредственно перед началом эксперимента in vitro (рис. 2).

Тест-штаммы наносили на поверхность образцов в виде взвеси, количество бактерий в 1 мл которой составляло 10⁸ КОЕ/мл по стандарту оптической мутности 0,5 Мак-Фарланда (McFarland); грибов — 10⁶ КОЕ/мл. Инкубация проведена во влажной камере анаэростата при температуре 37° С (для анаэробных бактерий), а для грибов — в обычных условиях при температуре 22—24 °С. Эксперимент проводили в течение 40 мин, согласно общепринятой методике [14], с некоторыми модификациями.

Для очищения поверхности образцов от микроорганизмов, вступивших в процесс адгезии, выполнены следующие процедуры:

1. Образцы были трижды промыты встряхиванием в 10 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия для удаления всех не прилипших бактериальных (или дрожжевых) клеток.

2. Затем каждый образец помещен в специальные емкости, содержащие 1 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия, и проведена обработка в ультразвуковой ванне Ultrastom («Геософт», РФ) с частотой 60 кГц в течение 10 мин. Это позволило добиться перехода бактериальных (или дрожжевых) клеток, вступивших в процесс первичной адгезии к исследуемым образцам, во взвешенное состояние (рис. 3).

3. Из полученной взвеси проведен посев методом отпечатков и распределением микробных клеток по поверхности питательной среды стерильной петлей для получения изолированных колоний с целью их количественного учета:

— на 5% кровяной колумбийский агар («Himedia Labs», Индия) для анаэробных бактерий и стрептококков;

— на селективную среду M 1268 («Himedia Labs», Индия) для грибов Candida.

4. Посевы были помещены в анаэростат и инкубированы при температуре 37 °С в анаэробных условиях (для анаэробных бактерий) до 10 сут, а для дрожжевых грибов рода Candida albicans в обычных условиях при температуре 22—24 °С до 2 сут.

Оценку полученных изолированных колоний проводили с использованием исследовательского стереомикроскопа («Nikon», Япония) и определяли их количество в колониеобразующих единицах на 1 мл (КОЕ/мл). Из полученных данных вычисляли десятичные логарифмы степени микробной адгезии и рассчитывали индекс адгезии для каждого из исследованных тест-штаммов [14]. Результаты обработаны методом непараметрической статистики по Манну-Уитни (различия считали достоверными при р<0,05).

Результаты и обсуждение

В ходе экспериментов по изучению первичной микробной адгезии in vitro были получены следующие данные (табл. 1).

Примечание. * — различия с контролем (образец № 4) достоверны (p≤0,05).

Основные представители резидентной микробиоты полости рта характеризовались высоким индексом адгезии ко всем полимерным материалам, причем максимальные значения индексов отмечены у образцов Luxatemp — от 0,72 для A. naeslundii до 0,90 для S. sanguinis. Образцы исследуемых материалов NextDent и Detax, полученных методом 3D-печати, отличались умеренным уровнем адгезии в пределах 0,46—0,69. Следовательно, можно утверждать, что данные конструкционные материалы создают оптимальные условия для формирования зубной биопленки, представленной стабилизирующими резидентными видами актиномицетов и стрептококков.

Представители пародонтопатогенной микробиоты, напротив, отличались более низкими индексами адгезии, хотя и отмечалась зависимость от вида материала (табл. 2). Так, у напечатанных образцов материалов NextDent и Detax, полученных методом 3D-печати, индексы адгезии A. actinomycetemcomitans составляли 0,25 и 0,26 соответственно, что было статистически достоверно ниже, чем у образцов из Acrytemp и Luxatemp (0,32 и 0,35).

Примечание. * — различия с контролем (образец №4) достоверны (p≤0,05).

Разница в степени адгезии P. intermedia к исследуемым материалам была аналогичной и составляла 0,25—0,38, что было статистически достоверно ниже, чем у образцов Luxatemp (индекс адгезии 0,50).

Основной пародонтопатогенный вид P. gingivalis был максимально активным в отношении адгезии к образцам материалов Acrytemp и Luxatemp — индексы адгезии составили 0,65 и 0,67 соответственно, т.е. показатели были на высоком уровне. В то же время индексы адгезии данного штамма к образцам NextDent и Detax, полученным методом 3D-печати, были примерно на 30% ниже (0,45 и 0,43 соответственно), но все-таки максимальными для этих материалов по сравнению с другими тест-штаммами.

Еще один пародонтопатоген, обладающий свойствами промежуточного колонизатора, — F. periodonticum — отличался умеренной степенью адгезии к образцам Luxatemp (индекс 0,41) и статистически достоверно более низкой ко всем остальным исследуемым материалам (0,31—0,35).

Следовательно, в проведенном нами исследовании установлено, что представители пародонтопатогенной флоры обладают более высокой степенью адгезии к полимерным материалам Acrytemp, Luxatemp и статистически достоверно меньшей к NextDent и Detax, полученных методом 3D-печати.

Индекс адгезии двух взятых в исследование штаммов грибов C. albicans 01 и 02 (табл. 3) к исследуемым материалам оказался высоким у образцов Acrytemp и Luxatemp (0,65 и 0,66) и был достоверно ниже у образцов материалов NextDent и Dentax (0,51 и 0,62 соответственно). Примечательно, что у референтного штамма C. albicans NCTC 885—653 индекс адгезии был существенно ниже — от 0,48 у образцов Luxatemp до 0,37 у образцов NextDent. Только для этого материала получено статистически достоверное снижение индекса адгезии грибов, в то время как у остальных материалов значения индексов статистически достоверно не различались. Эти результаты свидетельствуют также и о том, что музейный штамм теряет способность к избирательной адгезии, в то время как у клинических изолятов она выражена.

Примечание. Различия достоверны (p≤0,05) по сравнению * — с контролем (образец №4); ** — с референтным штаммом ATCC686.

Следовательно, разные штаммы дрожжевых грибов C. albicans — клинические изоляты и музейные (референтные) по-разному взаимодействуют с исследуемыми материалами, но общей тенденцией является более низкий уровень адгезии грибов к образцам материалов, полученных с помощью аддитивной техники 3D-печати, по сравнению с традиционным методом (рис. 4).

Как известно, при некоторых клинических ситуациях требуется более длительное ношение полимерных мостовидных протезов (до 6 мес). Однако наряду с выполнением определенных функций (защитная, жевательная, эстетическая, коммуникативная) полимерные протезы в полости рта могут стать причиной развития или обострения заболеваний пародонта, осложнений, приводящих к несостоятельности стоматологического ортопедического лечения [4, 5].

Это происходит потому, что полимерные конструкционные материалы обладают более высокой способностью к адгезии на своей поверхности бактерий и грибов, обитающих в полости рта, по сравнению с эмалью зуба, и таким образом реализуется потенциал микробного консорциума при формировании агрессивной микробной биопленки [2, 10—12].

Заключение

Представители резидентной микробиоты рта обладают выраженной способностью адгезировать к полимерным материалам, используемым для изготовления временных реставраций (зубных шин), в то время как степень адгезии вирулентных видов пародонтопатогенной группы варьирует. Минимальная адгезия для пародонтопатогенных видов выявлена при использовании образцов материалов, полученных методом 3D-печати: NextDent и Detax по сравнению с полимерами Luxatemp и Acrytemp.

Степень адгезии микроорганизмов в свою очередь определяет особенности последующей микробной колонизации полимерных несъемных протезов (искусственных коронок, мостовидных конструкций, зубных шин). Поэтому их использование обуславливает необходимость проведения дополнительных гигиенических мероприятий, направленных на удаление пародонтопатогенной микробиоты и поддержание нормального качественного и количественного состава микробиоценоза полости рта в период стоматологического ортопедического лечения.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.