Введение

В последние десятилетия в мировой литературе появляется все больше сообщений, свидетельствующих об этиологической роли грибов рода Malassezia в возникновении системных инфекционных заболеваний среди иммунокомпрометированных пациентов. Особую группу составляют недоношенные новорожденные, из них наиболее уязвимой категорией в плане развития системных грибковых инфекций являются дети с очень низкой и экстремально низкой массой тела при рождении (ОНМТ и ЭНМТ), смертность среди которых может достигать 40%.

Частота встречаемости инфекционных заболеваний и сепсиса у новорожденных тем выше, чем меньше гестационный возраст (ГВ) и масса тела ребенка при рождении: у новорожденных массой тела <1000 г частота развития сепсиса составляет 20,8%, у новорожденных массой тела 1000 г и выше — 1%. Это связано с рядом морфологических и функциональных особенностей различных систем органов у недоношенных детей, которые являются причиной их уязвимости [1, 2].

Грибы рода Malassezia относятся к зооантропофильным диморфным дрожжеподобным базидомикотам (класс Малассезиомицеты) и включают 17 видов. В настоящий момент 10 видов являются представителями кожной микробиоты человека: M. arunalokei, M. dermatis, M. furfur, M. globosa, M. japonica, M. obtusae, M. restricta, M. slooffiae, M. sympodialis, M. yamatoensis. [3]. В дрожжевой фазе грибы представляют собой нормальный микробиом кожи, после перехода в мицелиальную фазу они могут проникать в роговой слой, тем самым индуцируя кожные заболевания. По этой причине в последние годы грибы рода Malassezia рассматриваются не только как комменсал, но и как патоген.

Долгое время единственным возбудителем системных микозов, вызванных грибами рода Malassezia, считали M. furfur. В настоящее время, по данным мировой литературы, уже три вида грибов описаны как причина гематогенной инфекции у человека: M. furfur, M. sympodialis и M. pachydermatis [4—7]. Первые два вида являются представителями нормобиоты кожи человека, тогда как M. pachydermatis колонизирует кожу преимущественно теплокровных животных и представляет собой одну из причин возникновения отитов у собак. Ряд исследований, посвященных изучению микозов у пациентов, находящихся на лечении в ОРИТН, показал в качестве механизма возможность передачи возбудителя от медперсонала к пациентам. Более того, в современной литературе описаны случаи вспышек малассезиа-ассоциированных инфекций в отделениях реанимации и интенсивной терапии новорожденных, обусловленных M. pachydermatis [8, 9].

Отсутствие возможности синтеза de novo жирных кислот (ЖК) у грибов рода Malassezia (за исключением M. pachydermatis) определяет необходимость использования внешних источников липидов для поддержания процессов жизнедеятельности грибковых клеток. Именно эта физиологическая особенность не позволяет культивировать грибы на селективных для дрожжевых грибов плотных питательных средах и стандартных питательных средах для гемокультивирования и, соответственно, не позволяет выделить и идентифицировать их традиционными культуральными методами, что создает определенные сложности при проведении диагностического поиска. В связи с этим все большую популярность в диагностике возбудителей микозов в настоящее время приобретают молекулярно-генетические методы (ПЦР в режиме реального времени, секвенирование 18(26)S pРНК), позволяющие провести точную и быструю идентификацию грибов до вида при использовании минимального количества биологического материала в кратчайшие сроки [10].

Цель исследования — изучить особенности колонизации грибами рода Malassezia различных биотопов у новорожденных в условиях неонатального стационара.

Материалы и методы

На базе ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России (далее — Центр) было проведено проспективное когортное наблюдательное исследование. В исследование были включены новорожденные, находившиеся на обследовании и лечении в неонатальных отделениях Центра в период с 01.04.2022 по 31.01.2024. Дизайн исследования указан на рис. 1.

Рис. 1. Дизайн исследования.

В 30 образцах не был указан локус взятия биоматериала, поэтому в дальнейший анализ они включены не были.

Дети с критическими пороками развития (n=76), а также умершие пациенты (n=16) были исключены из исследования, поскольку тяжелые аномалии развития являются существенным фактором, влияющим на тяжесть состояния и выживаемость, независимо от колонизации грибами, и, соответственно, искажающим полученные результаты.

У законных представителей пациентов было получено информированное согласие о возможности использования их биологического материала для научных исследований. В исследовании, которое было одобрено этическим комитетом, использовался остаточный биологический материал, полученный в ходе клинического обследования.

Все пациенты, включенные в исследование, были разделены на 3 группы в зависимости от ГВ: I группа — дети ГВ ≤28 нед (n=29); II группа — дети ГВ 28,1—32,0 нед включительно (n=58); III группа — дети ГВ ≥32,1 нед (n=191) [11]. Для оценки тяжести состояния и степени выраженности полиорганной недостаточности использовалась оценочная шкала NEOMOD. Оценка рассчитывалась на основании анализа данных дневников интенсивного наблюдения за пациентами после поступления в ОРИТН (использовалось максимальное значение баллов за рассматриваемый период).

Совокупная тяжесть клинического состояния новорожденных в абсолютном большинстве случаев определялась наличием респираторного дистресс-синдрома, инфекционно-воспалительных заболеваний неонатального периода бактериальной и грибковой природы.

Выделение ДНК из образцов клинического материала проводили при помощи набора ПРОБА-ОПТИМА (ООО НПО «ДНК-Технология», Россия) согласно инструкции.

Выявление и типирование возбудителей грибковых инфекций проводили при помощи набора реагентов МикозоСкрин (ООО НПО «ДНК-Технология», Россия), а также с помощью тест-системы, специально разработанной для данного исследования отделом НИОКР ООО «ДНК-Технология», которая позволяет методом ПЦР в режиме реального времени количественно определять следующие виды грибов: M. sympodialis, M. pachydermatis, M. restricta, M. globosa, поскольку они описаны как наиболее часто встречаемые.

Аналитическая чувствительность тест-систем составляла 2,5 ГЭ/образец, в связи с этим при анализе результатов количественной оценки содержания дрожжевых грибов в образце фактом наличия соответствующего вида считали превышение порога аналитической чувствительности. Факт контаминации исключали путем соблюдения стандартных операционных процедур (СОП) при взятии биологического материала у новорожденных. Учитывая особенности нахождения новорожденных в микроклимате кювеза, а также осмотр и совершение манипуляций с использованием средств индивидуальной защиты (лицевая маска, индивидуальный фартук, перчатки), полученные количественные значения до 2,5 ГЭ считаются фоновыми, а значения свыше — диагностически значимыми.

Статистическая обработка

Статистическая обработка проводилась с помощью компьютерной программы IBM SPSS Statistics версии 26. Для непрерывных числовых показателей в качестве меры центральной тенденции рассчитывали медиану (Me), для оценки величины разброса — интерквартильные интервалы (25-й и 75-й процентили). Результаты представлены в виде Me (Q₂₅—Q₇₅).

При сравнении частоты встречаемости качественных признаков в двух независимых группах использовали критерий χ², а при малом количестве наблюдений в страте (<5) — точный критерий Фишера.

На основании распределения теста χ² рассчитывали 95% доверительные интервалы для операционных характеристик и частот [13]. Для расчета доверительного интервала доли использовали метод Уилкоксона.

Результаты

Минимальный ГВ пациентов, включенных в исследование, составил 23,6 нед, а максимальный — 41,3 нед. Клиническая характеристика пациентов представлена в табл. 1.

Из 1139 новорожденных грибы рода Malassezia были обнаружены у 278 (24,4%), у которых в ходе микробиологического мониторинга или при обследовании по показаниям в ходе лечебного процесса была обнаружена Malassezia spp. хотя бы в одном локусе.

Наиболее часто грибы рода Malassezia выявляли в соскобах из желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) — 76 (41,1%) из 185 образцов (соскобы со слизистой оболочки прямой кишки — 42 (53,1%) образца из 79, соскобы со слизистой оболочки ротоглотки — 34 (32,1%) образца из 106), трахеобронхиальный аспират — 20 (24,1%) образцов из 83. В крови и моче Malassezia выявлялась значительно реже — 39 (8,1%) из 484 и 4 (8,2%) из 49 образцов соответственно, что могло свидетельствовать о манифестации инвазивного микоза. Результаты исследований совпадали с результатами микробиологического мониторинга, однако сравнительная оценка не входила в задачи исследования.

Была проанализирована частота встречаемости различных видов Malassezia в образцах биоматериалов, полученных из различных биотопов новорожденных. По частоте выявляемости виды грибов распределились следующим образом: M. furfur — 72 (5,9%) образца, M. restricta — 38 (3,5%), и M. globosa — 14 (1,3%). Следует отметить, что у 1 ребенка, рожденного на 27-й неделе гестации, находящегося на ИВЛ и энтеральном питании, однократно при обследовании на 26-й день пребывания в ОРИТН в соскобе из ануса был найден вид M. pachydermatis в количестве 2,5 ГЭ. Вид M. sympodialis обнаружен не был.

Частота встречаемости Malassezia spp. в соскобе из ротоглотки у новорожденных в первые 2 нед составляла 7%, затем наблюдался постепенный подъем с пиком на 29—35-й день жизни (50,0%). Аналогичную динамику мы наблюдали при анализе образцов соскобов со слизистой оболочки прямой кишки: повышение частоты встречаемости Malassezia spp. вплоть до 4—5-й недели жизни 87,5%. Ожидаемо наблюдается похожая картина для M. furfur с пиком на 5-й неделе для обоих соскобов (37,5% — соскоб из ротоглотки, 87,5% — соскоб из ануса), поскольку M. furfur является наиболее часто встречающимся видом. В соскобе из ануса M. furfur выявлялась чаще, чем в соскобе из ротоглотки в течение всех периодов наблюдения.

Таким образом, на основании результатов исследования нами была выявлена выраженная динамика колонизации дрожжевыми грибами новорожденных в неонатальном и раннем постнеонатальном периодах, характеризующаяся увеличением степени колонизации на 3—5-й неделе жизни (рис. 2 на цв. вклейке).

Рис. 2. Частота выявления дрожжевых грибов в соскобах из ЖКТ у новорожденных в зависимости от возраста ребенка.

Оценка тяжести состояния новорожденных и степени выраженности полиорганной недостаточности

У детей, тяжесть состояния которых составляла <7 баллов по шкале NEOMOD, колонизация грибами рода Malassezia наблюдалась на 2-й неделе жизни (9,4%), достигая пика к 5-й неделе жизни.

Новорожденные, у которых тяжесть состояния по шкале NEOMOD составляла 7 баллов и более, колонизировались Malassezia быстрее, достигая пика уже на 2-й неделе жизни. Частота выявления грибов рода Malassezia spp. составила 42,9%, а вида M. furfur — 35,7% (рис. 3 на цв. вклейке).

Рис. 3. Частота выявления дрожжевых грибов в зависимости от тяжести состояния и возраста новорожденных.

Целью настоящей работы не являлось описание специфических местных и системных инфекционно-воспалительных процессов, вызванных дрожжевыми грибами, но с учетом снижения колонизационной резистентности слизистых оболочек и иммунологической толерантности у недоношенных детей при увеличении титра грибов в биотопах, а также при увеличении длительности пребывания в ОРИТН и контакта с грибковой микрофлорой совокупная тяжесть клинического состояния усугублялась.

Частота выявления дрожжевых грибов в зависимости от гестационного возраста новорожденного

Статистически значимая связь была выявлена только между M. furfur и ГВ: между детьми ГВ ≤28 нед и 28,1—32,0 нед (p=5·10^–5); между детьми ГВ ≤28 нед и ≥32,1 нед (p=4·10^–9). Остальные проанализированные виды грибов, колонизирующие слизистые оболочки, в большей мере относятся к представителям нормобиоты, поэтому их выявление не вносит вклад в тяжесть состояния, что, возможно, определяет отсутствие статистически значимой связи между частотой их встречаемости и ГВ. M. furfur — наиболее представленный вид грибов как по частоте встречаемости, так и по абсолютному количеству в образцах, тогда как наличие грибов видов M. restricta и M. globosa можно отнести к фоновому. В течение неонатального периода выраженной динамики колонизации видами M. restricta и M. globosa не наблюдалось.

Был проведен более детальный анализ особенностей колонизации новорожденных M. furfur в течение неонатального и раннего постнеонатального периодов. У детей ГВ ≤28 нед колонизация M. furfur начинает определяться и возрастает с 1-й недели жизни. Колонизация M. furfur у детей большего ГВ определяется и начинает возрастать позднее, на 8—14-й день жизни, что может быть связано как с большей зрелостью их иммунной системы, так и с меньшей продолжительностью этапа полного парентерального питания. К началу 6-й недели жизни частота колонизации M. furfur у новорожденных всех ГВ становится сравнимой и колеблется от 15 до 23%. Рост частоты встречаемости грибов вида M. furfur у новорожденных, сумма баллов которых при оценке по шкале NEOMOD не превышала 7, приходился на 8—14-е сутки жизни, а у новорожденных с суммой баллов ≥7 по шкале NEOMOD — на 1-ю неделю жизни. Пик выявления M. furfur у новорожденных, у которых были более выраженные проявления полиорганной недостаточности, фиксировался на 15—21-е сутки жизни (62,5%), тогда как у другой группы пациентов динамика колонизации демонстрировала более плавные темпы прироста до 37,5% (рис. 4).

Рис. 4. Частота выявления грибов рода Malassezia у новорожденных различного гестационного возраста на 1-м месяце жизни.

На 1-м месяце жизни была обнаружена погранично значимая связь (p=0,055) между частотой выявления вида M. furfur во всех биотопах и тяжестью состояния новорожденных ГВ ≤28 нед (OR=6,6 (0,8—53,8)), тогда как после 1 мес жизни эти различия не имели статистической значимости (рис. 4, 5). Колонизация глубоконедоношенных детей ГВ ≤28 нед M. furfur вносила вклад в усугубление тяжести полиорганной недостаточности у данной категории новорожденных, что нашло отражение в повышении оценки по шкале NEOMOD 7 баллов и более.

Рис. 5. Частота выявления грибов M. furfur в зависимости от тяжести состояния детей в неонатальном и раннем постнеонатальном периодах.

NS — статистически незначимые различия.

Ограничения исследования

Работа проводилась на пределе аналитической чувствительности тест-системы.

Поскольку обследование детей проводилось по показаниям, частота выявления тех или иных видов дрожжевых грибов не тождественна их распространенности у данного контингента пациентов.

ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России является профильным стационаром по оказанию медицинской помощи беременным группы высокого перинатального риска, а также беременным с выявленными антенатально пороками развития плода, что определяет особенности выборки при проведении исследования.

Обсуждение

У новорожденных, находящихся в неонатальных отделениях Центра, были выявлены 4 вида грибов рода Malassezia. Наиболее часто выявлялись M. furfur (72 образца), затем — M. restricta (38 образцов), M. globosa была найдена 14 образцах, M. pachydermatis — в 1. Чаще всего грибы рода Malassezia встречались в ЖКТ (53,1% — в соскобе со слизистой оболочки прямой кишки и 32,1% — в соскобе из ротоглотки), где была выявлена выраженная динамика колонизации дрожжевыми грибами на протяжении неонатального и раннего постнатального периодов, характеризующаяся увеличением частоты колонизации на 3—5-й неделе жизни.

Была обнаружена погранично значимая связь (p=0,055) между частотой выявления M. furfur и тяжестью состояния новорожденного в 1-й месяц жизни в группе детей ГВ ≤28 нед, в последующие периоды жизни статистически значимой связи выявлено не было. Это может быть ассоциировано с рядом физиологических и иммунологических особенностей глубоконедоношенных детей: снижением пула лейкоцитов и нейтрофилов, низкой колонизационной резистентностью слизистых оболочек, увеличением экспрессии TLR4, относительно большой площадью иммунологической поверхности кишечника и обильной васкуляризацией кишечника. В то же время именно этой группе новорожденных требуется длительное проведение зондового питания, что может явиться дополнительной предпосылкой для колонизации слизистых оболочек ЖКТ. Увеличение длительности колонизации грибковой микрофлорой при определенных условиях может стать дополнительным фактором риска развития местных и системных инфекционно-воспалительных процессов и в свою очередь вносить вклад в усугубление тяжести состояния новорожденных.

Заключение

Проведенное исследование показало целесообразность применения в ежедневной клинической практике молекулярно-генетических методов исследования, позволяющих с использованием малоинвазивных методик контролировать динамику колонизации слизистых оболочек грибами рода Malassezia у новорожденных и своевременно назначать таргетную терапию при развитии микозов.