Спектроскопические исследования изменений в молекулярном составе ротовой жидкости у людей с множественным кариесом зубов

Как известно, слюна представляет собой одну из наиболее информативных жидкостей человеческого организма для диагностики различных заболеваний [1, 2]. По сравнению с двумя другими жидкостями человеческого организма, а именно мочой и кровью, при проведении клинической диагностики слюна имеет ряд неоспоримых преимуществ: забор слюны прост и неинвазивен, а пробоподготовка содержит меньшее число операций [3]. При этом следует отметить, что большинство биомаркеров, которые содержатся в крови и моче, могут быть обнаружены в образцах слюны [4, 5]. Поэтому слюна обладает высоким диагностическим потенциалом для исследований патологий организма человека [6—10].

В настоящее время большое внимание уделяется использованию слюны в диагностике системных заболеваний органов полости рта: десен, зубов, слюнных желез [4, 6, 8, 11]. Ассоциированные с кариесогенной ситуацией изменения в молекулярном составе слюны могут выступить в роли эффективных биомаркеров развития кариеса зубов [4, 11, 12]. Оптимальным методом, зарекомендовавшим себя в области различных задач по исследованию изменений в молекулярном составе как слюны, так и биологических жидкостей человеческого организма, является инфракрасная (ИК) спектроскопия (Fourier-transform infrared spectroscopy — FTIR) [6, 13]. ИК-спектроскопия успешно используется для выявления биомаркеров патологий в слюне [6], а с развитием спектроскопических экспресс-методик анализа слюны человека скрининг заболеваний на молекулярном уровне стал возможным на еще более ранней стадии [13].

Цель исследования — изучение изменений в молекулярном составе слюны у людей с множественным кариесом с использованием спектроскопических методов анализа, а также поиск потенциальных биомаркеров кариозного процесса.

В исследовании приняли участие 20 человек (10 мужчин и 10 женщин) в возрасте 22—28 лет, предоставивших для исследований свою ротовую жидкость. Все участники исследования не принимали лекарственные препараты, не курили и не употребляли алкоголь.

В 1-ю группу эксперимента включили физически здоровых, без вредных привычек (не курящие сигареты), без кариеса зубов и заболеваний десен 5 мужчин и 5 женщин. Во 2-ю группу вошли условно здоровые (не курящие сигареты) 5 мужчин и 5 женщин. Участники этой группы в своей повседневной жизни не соблюдали режим питания, употребляя между основными приемами пищи легкоусвояемые углеводы. На момент обследования у каждого участника этой группы имелись зубы с очагами первичного и вторичного кариозного процесса в стадии, соответствующей III степени по шкале ICDAS.

Образцы нестимулированной смешанной слюны брали спустя 5 мин после предварительного ополаскивания ротовой полости с использованием чистой воды в стерильные 15 мл пробирки в период с 10 до 12 ч дня для минимизации влияния циркадного ритма в лабораторных условиях по стандартной методике [13]. Схема исследования изображена на рис. 1.

Исследования молекулярного состава образцов смешанной слюны человека, а также изменений в нем в зависимости от группы участников были выполнены с использованием методики ИК-спектроскопии [13]. Анализ образцов смешанной слюны был выполнен на приборе Vertex-70 («Bruker», Германия) по методике, описанной нами ранее [13].

Кроме того, для исследования было привлечено оборудование канала инфракрасной микроспектроскопии австралийского синхротрона. Использовались ИК-микроскоп Hyperion 3000 IR (фирмы «Bruker», Германия) и алмазная ячейка высокого давления для анализа микропроб образцов.

Предварительный анализ данных, полученных методом FTIR, показал, что спектры всех образцов внутри конкретной экспериментальной группы содержат абсолютно один и тот же набор колебательных мод, что совпадает с данными известных работ по исследованию биологических жидкостей [6, 13].

Так как зарегистрированные в нашей работе колебательные моды в ИК-спектрах образцов внутри каждой из групп участников эксперимента незначительно различались по интенсивности, достаточно привести лишь ИК-спектры ротовой жидкости, усредненные по группе лиц, участвовавших в эксперименте [14].

На рис. 1, б представлены усредненные ИК-спектры образцов смешанной слюны, полученных как от людей с множественным кариесом (кривая 1), так и от здоровых лиц (кривая 2). Список активных колебаний в спектрах, полученных в 1-й и 2-й группах, частоты этих колебательных мод, а также их принадлежность к конкретной молекулярной группе приведены в таблице.

Из полученных нами экспериментальных данных (см. рис. 1; см. таблицу) следует, что основные интенсивные колебательные полосы в ИК-спектрах пропускания слюны и содержащиеся во всех спектрах принадлежат следующим группам и комплексам.

Первая и наиболее интенсивная группа колебаний, расположенная в области 1078—900 см^–1, принадлежит молекулярным связям, относимым к производным фосфора, таким как фосфаты, глицерофосфаты и фосфолипиды [13]. Следующая большая группа колебательных полос, локализованных в области 1725—1190 см^–1, принадлежит протеинам. Среди этой группы могут быть выделены полосы вторичных амидов: Амид I, Амид II и Амид III, а также колебания групп CH₂/CH₃.

Наряду с описанными выше модами колебаний в спектрах обнаруживаются полосы, интенсивность которых зависит от наличия заболевания кариесом зубов. Наиболее интенсивным колебанием в этой группе полос является мода в области 2150—1950 см^–1. Эту моду в ИК-спектре можно отнести к связи –N=C=S анионов тиоцианатов, содержащихся в смешанной слюне. Визуальный анализ интенсивности этого колебания показывает, что в спектре образцов ротовой жидкости, полученных от пациентов с множественным кариесом, это колебание значительно выше, чем у участников из 1-й группы. Хорошо известно [16], что тиоцианаты служат локальными антибактериальными агентами для анаэробных микроорганизмов. Следует отметить, что наличие тиоцианатов в слюне может также свидетельствовать о состоянии местного иммунного статуса ротовой полости.

Особое внимание привлекают три области: 1765—1725, 1185—1140 и 870—700 см^–1, в которых колебания в ИК-спектрах наблюдаются лишь в образцах, полученных в группе участников эксперимента с множественным кариесом. Первые две области в увеличенном масштабе представлены на рис. 1, в, г. Анализ литературы показывает, что колебательная полоса в области 1185—1140 см^–1 (см. рис. 1, г) относится к присутствующим в ротовой жидкости карбогидратам. Они входят в состав муцинов слюны, которые покрывают и смазывают поверхность слизистой оболочки, предотвращают прилипание анаэробных бактерий и их колонизацию, защищают ткани от физического повреждения. Мода ИК-полос в области 1765—1725 см^–1 (см. рис. 1, в) в соответствии с данными работ [6] представляет собой колебание >C=O и соотносится с карбоновой группой сложного эфира. Отметим, что наличие эфиров в твердой ткани зуба человека при кариесе зубов было показано в ряде работ [6, 7]. При этом авторы этих работ указывали, что в кариозной ткани эфиры встречаются чаще, чем в интактной.

В третьей особой области, как отмечалось ранее, в диапазоне 870—700 см^–1 имеется ряд малоинтенсивных мод колебаний. Из анализа литературы известно, что данные колебательные моды принадлежат связям С—Н, P—O фосфодиэфиров, сложных эфиров, других липидов и углеводов слюны. Причиной возрастания интенсивности этой группы колебаний в спектре 2-й группы участников эксперимента является увеличение концентрации липидов и относящихся к ним сложных эфиров слюны вследствие развития кариеса зубов, как это показано в работе [17].

Чтобы дать количественные оценки с использованием данных ИК-спектроскопии и установить разницу в молекулярном составе ротовой жидкости между группой здоровых пациентов и группой пациентов с множественным кариесом мы использовали подход, апробированный в ряде наших предыдущих работ [13, 18]. В них показано, что математическая оценка изменений в молекулярном составе слюны может быть дана на основе расчета и анализа четырех различных соотношений (коэффициентов).

Для расчета первого из них — R1 (минерал-органическое соотношение) достаточно взять отношение интегральной интенсивности фосфатных полос в ИК-спектре, к интегральной интенсивности полосы колебаний, соотносимой с Амид I. Второй коэффициент — R2 (углерод-фосфатное отношение) может быть рассчитан из отношения интегральной интенсивности полосы колебаний связей C=O и CH₂/CH₃ к интегральной интенсивности фосфатных полос в ИК-спектре.

Третий коэффициент — R3 (Амид II/Амид I) рассчитан из отношения интегральной интенсивности полосы Амид II к интегральной интенсивности полосы Амид I.

Четвертый коэффициент — R4 (протеин/тиоцианатное соотношение) может быть рассчитан из отношения интегральной интенсивности амидных полос (Амид I и Амид II) к интегральной интенсивности полосы колебаний –N=C=S, соотносимой с тиоцианатом.

Результаты расчетов соотношений R1—R4 для двух групп участников исследования приведены на рис. 2, а

Комплексная оценка полученных экспериментальных результатов ИК-спектроскопии и расчетных данных, приведенных на рис. 1 и 2, позволяет сделать следующие важные выводы.

Хорошо видно, что в случае наличия множественного кариеса у пациентов наблюдается уменьшение минерал-органического соотношения — коэффициент R1 (см. рис. 2, a), что свидетельствует о сокращении в составе слюны доли минеральных групп и комплексов и/или возрастании части органической компоненты при наличии в смешанной слюне кариесогенных бактерий [11, 12]. При этом следует отметить значительное (по результатам расчета) увеличение коэффициента R3 (отношение интегральных площадей Амид II/Амид I) для группы лиц с множественным кариесом около 120% (см. рис. 2, в). Это означает, что изменения в составе органической компоненты ротовой жидкости, полученной у волонтеров 2-й группы, обусловлены увеличением количества молекулярных групп CN и NH по отношению к доле связей C=O (см. рис. 1; см. таблицу). Согласно данным литературы, эти молекулярные группы относятся к белковой составляющей, изменение доли которой может происходить вследствие появления патологической микрофлоры ротовой полости как в нестимулированной, так и в стимулированной слюне [11, 12].

Относительное изменение углерод-фосфатного соотношения R2 (см. рис. 2, б) также указывает на различия в молекулярном составе образцов смешанной слюны, полученных от пациентов 1-й группы и участников из группы с множественным кариесом. Показано, что коэффициент R2 для группы волонтеров с множественным кариесом почти на 16% больше, чем для 1-й группы участников (см. рис. 2, б). Увеличение коэффициента R2 обусловлено снижением доли фосфатных комплексов в молекулярном составе ротовой жидкости и увеличением доли связей, относимых к C=O и CH₂/CH₃.

Кроме того, показательные изменения в составе ротовой жидкости происходят в отношении числа групп –N=C=S, соотносимых с наличием в слюне тиоцианатов (см. рис. 1, г). В соответствии с данными литературы уровень тиоцианатов в слюне, оказывающий антибактериальное действие на продукты жизнедеятельности бактерий, при патологических процессах может повышаться. Коэффициент R4, который является протеин/тиоцианатным соотношением, демонстрирует практически двукратное уменьшение. При этом, если относительные изменения соотношений R1 и R3 указывают на заметное увеличение доли органики (в том числе протеинов) в составе смешанной слюны, то уменьшение соотношения R4 почти в 2 раза обусловлено весьма значительным увеличением доли тиоцианатов в слюне у лиц с множественным кариесом.

Что же касается выводов о качественных изменениях в составе ротовой жидкости при множественном кариесе, то исходя из экспериментальных данных FTIR (см. рис. 1) весьма важными и показательными являются различия в ИК-спектрах в области 1765—1725 см^–1 (см. рис. 1; см. таблицу), в которой расположены колебательные полосы, относящиеся к карбогидратам и карбоновой группе сложного эфира. Как хорошо видно из полученных экспериментальных данных, эти две низкоинтенсивные полосы определяются лишь в спектрах образцов ротовой жидкости 2-й группы участников эксперимента, страдающих множественным кариесом. Сделанные нами заключения совпадают с результатами других работ [17, 19].

Все описанные особенности в ИК-спектрах ротовой жидкости хорошо согласуются с известными результатами ряда работ по исследованию развития патологических процессов в ротовой полости, в том числе кариозного процесса [4, 11, 12, 17].

Подводя итоги, следует отметить один немаловажный факт. Как показано в предыдущих исследованиях, ни один из антимикробных агентов (в том числе тиоцианат), как и интегральные маркеры слюны, не обладают прогностической значимостью, достаточной для диагностирования in vivo появления в будущем кариеса, и слабо ассоциированы с динамикой развития кариеса зубов [16]. Поэтому, по нашему мнению, повысить точность детекции развития кариозного процесса можно лишь на основе комплексного анализа количественных и качественных данных об изменениях в молекулярном составе ротовой жидкости.

Методом FTIR, в том числе с использованием синхротронного излучения, определены особенности в ИК-спектрах, а также рассчитаны минерал-органическое, углерод-фосфатное, Амид II/Амид I и протеин/тиоцианатное соотношения для группы лиц, больных с множественным кариесом, и пациентов контрольной группы.

На основе комплексного анализа экспериментальных данных удалось показать, что органоминеральный баланс ротовой жидкости у лиц, страдающих множественным кариесом, сдвигается в сторону сокращения содержания в ней минеральных групп и комплексов и увеличения органической составляющей. Интегральным показателем этих изменений молекулярного состава служит отношение Амид II/Амид I. В группе с множественным кариесом это соотношение возрастает почти на 120% по сравнению с таковым в группе здоровых пациентов.

В случае множественного кариеса зубов в образцах смешанной слюны более чем в 2 раза увеличивается содержание тиоцианатов. Кроме того, в смешанной слюне появляются карбоновые группы сложных эфиров, липидов и углеводов, наличие которых характерно при развитии кариеса.

Полученные нами комплексные результаты и отработанная методика могут использоваться соответственно в качестве биомаркеров и диагностического подхода при анализе образцов смешанной слюны пациентов для оценки кариесогенной ситуации.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 16−15−00003).

Часть данного исследования выполнена на канале инфракрасной микроспектроскопии австралийского синхротрона.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Середин П.В. — https://orcid.org/0000-0002-6724-0063

Голощапов Д.Л. — https://orcid.org/0000-0002-1400-2870

Ипполитов Ю.А. — https://orcid.org/0000-0001-9922-137X

Авраамова О.Г. — https://orcid.org/0000-0001-6000-5039

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Середин П.В., Голощапов Д.Л., Ипполитов Ю.А., Авраамова О.Г. Спектроскопические исследования изменений в молекулярном составе ротовой жидкости у людей с множественным кариесом зубов. Стоматология, 2019;98(5):-55. https://doi.org/10.17116/stomat201998051