По опросам пациентов, на первом месте среди причин недовольства проведенным лечением стоит неудовлетворительная эстетика [1, 5]. Определенную трудность у врачей вызывают реставрации зубов у пациентов среднего и пожилого возраста. Несмотря на обилие материалов, существующие методики реставраций не универсальны, нет четко разработанного алгоритма нанесения слоев композита, особенно эмалевого слоя. Кроме того, существующая система цветового планирования реставраций не дает ответа на один из главных вопросов — за какие параметры отвечает дентин, а за какие эмаль [2].

Общеизвестно, что оптические параметры твердых тканей зуба, в частности эмали, напрямую связаны с ее морфологией и происходящими в ней возрастными физиологическими процессами. Данные процессы часто встречаются в литературных источниках под термином «минерализация эмали» [3]. Однако данный термин нам представляется не совсем корректным ввиду того, что процессы минерализации являются сугубо химическими, а изменение кристаллической структуры гидроксиапатита (ГАП) — физический процесс, при неизменном химическом составе самого ГАП [4, 6]. В современной литературе данному вопросу уделяется крайне мало внимания.

Поэтому в зависимости от задач и объемов реставрации при ее цветовом планировании следует выбирать материал, учитывая морфологическое состояние эмали и понимая, что, реставрируя зуб, мы в первую очередь его лечим, что эта работа ведется хотя и по законам эстетики, но представляет собой врачебную деятельность, чему и посвящено данное исследование.

Цель исследования — определение структуры кристалла ГАП эмали в зависимости от топографии и физиологических изменений в процессе жизнедеятельности.

Для этого с помощью комплекса лабораторных методов исследования изучали морфологическое состояние основной структурной единицы эмали — кристалла ГАП и на основании полученных данных выделяли оптически значимые анатомические зоны эмали, клинически определяемые с использованием систем оценки цветовых параметров эмали и дентина.

Материалом для исследований in vitro служили фрагменты эмали верхней, средней и нижней трети коронковой части 20 удаленных по различным медицинским показаниям фронтальных зубов (острая механическая травма, заболевания пародонта и т. д.) для возрастных групп 20—30, 31—40, 41—50 и 51—60 лет (по 5 зубов для каждой возрастной группы).

При исследовании морфологического состояния кристаллов ГАП использовалась растровая электронная микроскопия (РЭМ), атомно-силовая микроскопия, регистрация инфракрасных (ИК)-Фурье спектров и метод рентгенофазового анализа эмали.

Данный метод позволяет определить присутствие различных фаз, наличие примесей и произвести расчеты по определению величины кристаллов ГАП эмали.

Рентгенографический фазовый анализ любых объектов осуществляется сравнением экспериментальной дифракционной картины — набора межплоскостных расстояний и интенсивностей рефлексов — с дифракционными картинами табличных эталонов, поскольку данные величины связаны с индивидуальными параметрами и координатами атомов решетки каждой конкретной фазы. Измеренные интенсивности вводились и обрабатывались в программном комплексе Microcal Origin 6.0.

Метод ИК-спектроскопии способствует изучению внутри- и межмолекулярных взаимодействий в исследуемых кристаллах ГАП. При поглощении инфракрасного излучения происходит возбуждение колебаний и вращений молекул, которые являются квантованными. Исследования осуществлялись при помощи ИК-Фурье-спектрометра VERTEX 70 на приставке фирмы «BRUKER».

Изучение морфологии образцов эмали осуществлялось на сканирующем электронном микроскопе JEOL JSM-6380LV.

Получение микрофотографий образцов производилось с подготовкой, связанной с особенностями вещества: образцы опылялись золотом, так как исходные материалы имеют диэлектрические свойства и сильно заряжаются в камере микроскопа.

Определение элементного анализа изучаемых материалов производилось на приставке Inca-250.

Поверхность эмали зуба исследовалась в полуконтактном режиме на сканирующем зондовом микроскопе Solver P47 Pro. Неоднородность свойств поверхности контролировалась методом отображения фазы.

Согласно цели и задачам исследования в лабораторных условиях произведен синтез и описание образцов нанокристаллического ГАП методом преципитации из источника биогенного происхождения, обнаружены особенности характеристик, объясняемые размерным фактором. Затем производилось сравнение полученного нанокристаллического ГАП и поликристаллического, синтезированного по стандартной технологии. На заключительном этапе производилась сравнительная характеристика свойств ГАП различных анатомических зон эмали и синтезированных контрольных образцов при помощи методов, описанных выше.

На первом этапе исследований была произведена сравнительная характеристика синтезированных кристаллов ГАП (рис. 1).

На рис. 1 приведены дифрактограммы стандартного поликристаллического ГАП стехиометрического состава с размером кристаллитов ≈500 нм (кривая 1) и синтезированного контрольного нанокристаллического ГАП (кривая 2). Определение фазового состава производилось путем сопоставления рентгенодифракционных данных с данными стандартных таблиц JCP-DS-ICDD. Как видно из сопоставления межплоскостных расстояний и интенсивностей, синтезированный материал представляет собой ГАП. На дифрактограммах всех исследованных образцов не было обнаружено лишних линий. Однако, в сравнении с поликристаллическим образцом ГАП, принятым в качестве стандарта, синтезированный ГАП обладает менее интенсивными и более широкими линиями (кривая 2, см. рис. 1). Оценка величины кристаллитов полученного материала была проведена по уширению рентгендифракционных линий в сравнении с поликристаллическим образцом.

Анализ проводился по рефлексу 002 по формуле Шерерра:

d= ______ ,

βcosq

где d — средний размер кристаллитов: k — константа, близкая к единице, λ — длина волны рентгеновского излучения (Сu Ка; 1.45°); β — уширение рентгеновского рефлекса, β=(В²—b²)^½, где В — полуширина дифракционного пика 002, измеряемая в радианах; b — полуширина дифракционного пика 002 эталонного поликристаллического образца, также измеряемая в радианах; cos θ — косинус угла Вульфа—Брэгга, соответствующего рефлексу 002.

В результате расчета по вышеприведенной формуле величина кристаллов составила 30—34 нм, что согласуется с данными РЭМ и атомно-силовой микроскопии (табл. 1).

На следующем этапе производилась сравнительная характеристика рентендифракционных спектров контрольных образцов и ГАП эмали в области границы эмаль—дентин и с вестибулярной поверхности исследуемого зуба (рис. 2).

На рис. 2 приведены дифрактограммы от биогенного ГАП, полученные от среза эмали с внутренней (кривая 2) и внешней (кривая 3) сторон зуба, а также от синтетического ГАП (кривая 1).

Сопоставление межплоскостных расстояний и соответствующих им интенсивностей показывает, что как внутренняя, так и внешняя стороны среза зуба представляют собой ГАП. На соответствующих дифрактограммах 2 и 3 не обнаруживается лишних линий, что свидетельствует об однофазности исследуемого биогенного образца. Различия, наблюдаемые на данных дифрактограммах, объясняются субструктурными и морфологическими особенностями строения внешней и внутренней сторон среза эмали зуба. При сравнении с синтезированным образцом (кривая 1) на дифрактограммах исследуемых двух сторон среза зуба (кривые 2, 3) обнаруживаются различия в интенсивности и полуширине линий обеих дифрактограмм.

Наибольшее сходство по ширине и интенсивности рефлексов синтезированный материал имеет с дифрактограммой от внутренней стороны среза зуба, которая представляет собой слой эмали, пограничный с дентином. При этом в биогенном материале (кривая 2) рентгеновские рефлексы имеют меньшую интенсивность и полуширину, что свидетельствует о том, что кристаллиты ГАП имеют меньшие размеры по сравнению с синтезированным. Оценка размеров кристаллитов внутренней стороны среза зуба осуществлялась по полуширине рефлекса 002 дифрактограммы в сравнении с полушириной соответствующего рефлекса микрокристаллического ГАП, используемого в качестве эталона (кривая 1, см. рис. 1), по формуле Шерерра. Средний размер кристаллитов внутренней стороны среза зубной эмали составляет ≈15 нм (табл. 1).

Дифракторамма, полученная от вестибулярной стороны среза эмали зуба, существенно отличается от двух предшествующих дифрактограмм, прежде всего исчезновением рефлексов с индексами 211, 310 и значительным увеличением интенсивности отражений 002, 004. При этом ширина всех пиков уменьшается, а полуширина рефлекса 002, по которой оценивалась величина нанокристаллов в образцах 1 и 2, оказывается даже меньшей, чем в микрокристаллическом ГАП (кривая 1, см. рис. 1). Все эти факты свидетельствуют о влиянии текстуры, т. е. преимущественной ориентации структурных единиц эмали (призм ГАП) в кристаллографическом направлении — вдоль оси с гексагональной элементарной ячейкой биогенного ГАП.

Таким образом, по данным рентгеновского дифрактометрического анализа, установлено, что как исследуемые, так и контрольные синтезированные образцы являются однофазными и представляют собой кристаллический ГАП с различным размером кристаллитов.

По сравнению с поликристаллическим образцом ГАП (см. рис. 1, кривая 1) на синтезированном контрольном нанокристаллическом ГАП и ГАП в области границы эмаль-дентин (см. рис. 1, кривая 2; рис. 2, кривые 1, 2) обнаруживается уширение рентгеновских рефлексов, что связано с малым размером частиц изучаемых нанокристаллических ГАП (15—30 нм). В то же время изучение рентгеновских рефлексов дифрактограмм образцов ГАП, взятых с поверхности эмали (см. рис. 2, кривая 3) позволяет характеризовать их как поликристаллические. Использование формулы Шеррера позволило оценить их размер — 500—900 мкм.

При проведении лабораторной части исследования, метод ИК-спектроскопии использовался для обнаружения характерных химических связей, присутствующих в спектрах ГАП и обеспечивающих его кристаллическую ориентацию.

Результаты ИК-спектроскопии при исследовании контрольных нанокристаллических образцов позволили определить, что в данных образцах наличествуют все моды колебаний, имеющиеся у поликристаллического ГАП, полученного по стандартной технологии (рис. 3).

Как следует из рис. 3, основные для ГАП пики присутствуют во всех спектрах, но различаются по своей интенсивности. Так как величина колебательных связей, составляющих основу ГАП, известна, то по ИК-спектрам была произведена оценка их наличия и интенсивности в изучаемых образцах (табл. 2).

Представленные на рис. 4 ИК-спектры образца среза зуба с внешней (1) и внутренней (2) сторон и синтезированного ГАП (3) показывают небольшие различия в высокочастотной области спектра, обусловленные белковой составляющей зубной эмали. Кроме основных мод колебаний ГАП, представленных в табл. 2, в образце среза эмали зуба обнаруживаются моды СО-амидной группы, а также СН2 и ОН — в областях 2840, 2910 и 2370 см^–1 соответственно, отвечающие органической составляющей эмали зуба (белка коллагена). Таким образом, с точки зрения мод, отвечающих минеральной компоненте естественных тканей зуба, ИК-спектры обнаруживают колебательные моды, характерные для ГАП. Небольшие различия в структуре полос РО4 внешней и внутренней сторон среза эмали могут быть связаны с различной структурной организацией гексагональных призм ГАП внешней и внутренней сторон эмали.

С помощью сканирующей электронной микроскопии проводилась оценка размеров частиц, изучаемых образцов ГАП и сравнение их морфологических характеристик.

На рис. 5 представлено РЭМ-изображение контрольного образца поликристаллического ГАП, полученного по стандартной технологии. На рис. 6 представлено РЭМ-изображение образца микрокристаллического ГАП, полученного с вестибулярной поверхности эмали.

Из представленных снимков видно, что в поликристаллическом образце присутствуют в основном крупные частицы (до 400 мкм), а в микрокристаллическом — более мелкие (до 50 мкм).

При сканировании с различным разрешением соответствующей поверхности нативной эмали в различных направлениях отмечается четкая организация микрокристаллического ГАП в виде «эмалевых призм» (рис. 7, 8).

На рис. 9 представлено РЭМ-изображение синтезированного контрольного образца нанокристаллического ГАП, полученного по вышеописанной технологии.

На рис. 10 представлено РЭМ изображение образца нанокристаллического ГАП, полученного с границы эмаль—дентин.

Из представленных снимков видно, что в контрольном нанокристаллическом образце присутствуют частицы с преобладанием более крупных (до 5 мкм), а в нанокристаллическом образце биогенного происхождения — более мелкие (до 1—2 мкм). При сканировании соответствующей анатомической поверхности в различных направлениях не обнаруживалось признаков организации изучаемого ГАП в виде «эмалевых призм» или каких-либо других образований с геометрической ориентацией (рис. 11). При увеличении в 5000 раз поверхность визуально напоминала пчелиные соты.

При увеличении до 20 000 раз обнаруживалась однородная структура нанокристаллического ГАП без какой-либо геометрической ориентации (рис. 12).

При сканировании поверхности эмали на расстоянии 0,1 мм от эмалево-дентинной границы нами зарегистрирован переход нанокристаллической формы в микрокристаллическую, которая на снимках была представлена в виде «игольчатых» кристаллов (рис. 13).

В то же время, определенный интерес вызывало изучение так называемых «переходных зон», где происходит переход нанокристаллического ГАП в микро- и поликристаллический. Данный участок представлен на рис. 14.

Из рис. 14 следует, что «стержень» эмалевой призмы, состоящий из микрокристаллических форм, снаружи окутан нанокристаллами ГАП, которые по мере минерализации переходят в поликристаллические формы, что полностью согласуется с существующими на сегодняшний день взглядами на обменные процессы и созревание эмали.

Данные РЭМ полностью подтверждались результатами атомно-силовой микроскопии.

Площадь сканирования эмали варьировалась от 2×2 мкм (рис. 15, а) с разрешением от 7 до 40 нм.

При изучении поверхности зуба методом отображения фазы (см. рис. 15, б) обнаружена фазовая неоднородность сканируемой толщины слоя эмали, которая интерпретировалась как наличие аморфной и кристаллической фазы ГАП, так как гидроксиапатитные структуры, в том числе и в эмали зуба, кристаллизуются в гексагональной сингонии (пространственная группа P63/m) (~57%).

Как видно, биогенный ГАП характеризуется тем, что имеет возможность по-разному упаковываться в кристаллическую структуру. Для исследования важно то, что в биологических, как и в искусственных образцах ГАП мало того, что присутствует в гексагональной сингонии, но и стремится сохранить ее. Связано данное свойство с тем что из-за наличия дефектов, вакансий и замещений форма молекулы позволяет ОН-группе с большим ионным радиусом встраиваться в треугольники из катионов кальция, а, следовательно, гексагональная симметрия в данном случае выгоднее, нежели моноклинная.

Основу структуры ГАП [Са10(РО4)6(ОН)2] составляют изолированные фосфорно-кислородные тетраэдры (рис. 16), которые, объединяясь с помощью кальция Ca (1), образуют полые цилиндры (каналы), на стенках которых размещаются ионы кальция Ca (2), а по оси — одновалентные анионы.

В элементарной ячейке десять атомов кальция распределены по двум координационным положениям: Са (1) — 40% и Са (2) — 60% с симметрией С3 и С1h соответственно. Ионы Са (1) образуют параллельно оси с непрерывные колонки, в которой каждый ион связан с девятью ионами кислорода тетраэдров 3−PO4 (рис. 17), образуя координационные комплексы СаО9. Ближайшее окружение Са (2) образовано шестью атомами кислорода и гидроксильной группой СаО6ОН. Важная особенность структуры: наличие OH группы на оси 63.

Характерными чертами биоапатитов, как уже указывалось выше, являются субмикроскопический (нм) размер кристаллов, нестехиометрия состава (стехиометрическое отношение Са/Р=1,67), присутствие карбонат-иона, плохо окристаллизованная решетка и большая реактивность поверхности.

Морфологический облик биологических, синтетических и природных ГАПов может существенно различаться в зависимости от условий роста (главным образом величины рН), примесей, а также матрицы, на которой они формируются.

В биологических объектах влияние на рост кристаллов ГАП также оказывает фторапатит [Са10(РО4)6(F)2].

Кристаллохимической особенностью биологических апатитов, в том числе в эмали зуба, является постоянное присутствие в структуре карбонат-иона CO3²⁻, который в некоторых случаях может замещать анион PO4³⁻ (апатит β-типа), ОН-группы на оси 63 (А-тип) и находиться на поверхности в виде групп CO2.

Расчет состава и структуры биогенных минералов затруднен из-за невозможности проведения прецизионного рентгеноструктурного анализа. Значительная ширина дифракционных линий, обусловленная мелкокристалличностью образцов, не дает определить вещество. Сложность заключается еще и в том, что некоторые биоапатиты имеют почти одинаковые спектры, а следовательно, процесс расшифровки в данном случае имеет относительный характер.

Кроме того, отношение кальция к фосфору у биогенных образцов за счет физиологических и патологических процессов де- и реминерализации может изменятся от стехиометрического (1,67) в сторону фосфора (до 1,34) или кальция (до 1,77).

Толщина нанокристаллов ГАП эмали составляет всего 2—4 нанометра. Плоские нанокристаллы уложены параллельно друг другу внутри каркаса из молекул коллагена. Между соседними волокнами, расположенными друг под другом, имеются пустоты. В разных рядах пустоты находятся на разной высоте, что приводит к перекрыванию волокон (рис. 18).

Таким образом, при помощи комплекса лабораторных методов исследования, включающих рентгенфазовый анализ, инфракрасную спектроскопию, растровую и атомно-силовую микроскопию установлено:

— ГАП эмали имеет относительно стабильный химический состав и различную морфологическую кристаллическую структуру;

— процесс физиологических и возрастных изменений эмали (созревание эмали) являет собой переход ГАП из одной кристаллической фазы в другую (от нанокристаллической до поликристаллической);

— ГАП с различной морфологической кристаллической структурой имеют определенную анатомическую ориентацию — на границе эмаль—дентин расположены нанокристаллы, которые по мере минерализации трансформируются в микро- и поликристаллическую форму в направлении к вестибулярной поверхности зуба.

Из вышесказанного следует, что ГАП эмали по мере созревания переходит из нанокристаллической в микрокристаллическую фазу и, оценивая оптические характеристики эмали, мы, прежде всего, оцениваем соотношение имеющихся фаз ГАП, которое в свою очередь зависит от возраста пациента. Преимущественное содержание нанокристаллического ГАП, вследствие его оптических свойств (прозрачность только в одном направлении), придает эмали белый оттенок, и это характерно для молодого возраста. По мере созревания ГАП переходит в микрокристаллическую фазу, и эмаль становится прозрачной. Микрокристаллический ГАП в чистом виде придает эмали глубокий янтарный оттенок.

Главная проблема заключается в том, что основная масса пациентов, обратившихся по поводу прямых реставраций, находятся в возрасте от 18 до 30 лет, когда в эмали имеются обе фазы. И от того, насколько верно мы оценим их соотношение и воспроизведем его при помощи композита, зачастую и зависит успех реставрации.