Восстановление костной ткани после хирургических вмешательств, особенно в стоматологии, является одним из быстро развивающихся направлений медицины. Для применения в клинической практике перспективны синтетические материалы на основе фосфатов кальция [1].

В настоящее время много внимания уделяется материалам на основе трикальцийфосфата (ТКФ), который существует в 2 основных кристаллических модификациях: высокотемпературный — α-ТКФ и низкотемпературный β-ТКФ [3].

Теоретическая плотность β-ТКФ составляет 3,067 г/см³, температура разложения 1380 °С, α-ТКФ — соответственно 2,18 г/см³ и 1720 °С. Известны 4 модификации ТКФ — α-ТКФ, устойчивый при температуре от 1120 °С до 1470 °С; метастабильный (1120 °С); α-ТКФ, стабильный при температуре 1470 °С; β-ТКФ, стабильный при температуре 1120 °С [1, 6]. α-ТКФ имеет моноклинную сингонию с пространственной группой р21/а и параметрами решетки: а=12,887 Å; b=27,280 Å; с=15,219 Å; z=24; а β-ТКФ — ромбоэдрическую сингонию с пространственной группой R3c и параметрами ячейки: а=10,439 Å; с=37,375 Å; z=21 [2].

Биодеградация — одно из определяющих свойств остеопластических материалов. Показано, что керамические материалы на основе α- и β-ТКФ имеют высокую начальную скорость растворения в течение первых 5 дней, затем процесс растворения замедляется и переходит в экспоненциальный режим, а далее — в стационарный ввиду достижения состояния насыщения раствора [13]. Большей растворимостью обладают материалы на основе α-ТКФ [2], что согласуется с данными L. Chow [9].

Коммерческие изделия на основе ТКФ обозначаются по-разному (табл. 1).

В данной работе сравнивали остеопластические свойства керамических материалов на основе α- и β-ТКФ при замещении дефектов эпифиза бедренной кости крыс в разных условиях.

Синтез α-ТКФ. α-ТКФ получали спеканием дикальцийфосфата дигидрата CaHPO₄·2H₂O и карбоната кальция CaCO₃ при 1300 °С в течение 5 ч в реакции:

2CaHPO₄·2H₂O+CaCO₃→Ca₃(PO₄)₂+3H₂O+CO₂. (1)

Синтез β-ТКФ. Для получения β-ТКФ использовали растворы нитрата кальция Са(NО₃)₂·4Н₂О и гидрофосфата аммония (NH₄)2HPO₄, взятые в стехиометрическом соотношении:

3Ca(NO₃)₂+2(NH₄)2HPO₄+2NH₄OH→Ca₃(PO₄)₂↓+6NH₄NO₃+2H₂O. (2)

Изготовление керамических блоков. Высокопористую керамику получали методом наполнения ячеистого полимерного каркаса суспензией порошок/биополимер (инверсионный метод реплик) с последующей сушкой и термической обработкой. Данная технология позволяет получать материал с пористостью до 80 об.% с крупными взаимопроникающими порами размером 150—250 мкм, порами средних размеров (10—50 мкм), образующимися при выгорании неорганической части полимерного каркаса, с тонкими межкристаллическими порами, размером 0,1—5,0 мкм.

Суспензию порошок/биополимер готовили на основе водного раствора при соотношении 1/1 по массе. Пропитку полимерного каркаса осуществляли следующим образом: каркас заданной формы полностью погружали в керамический шликер, деформировали (сжатием) на 50%, после чего в результате восстановления объема каркаса шликер заполнял его свободное пространство. Образцы извлекали из суспензии и помещали в морозильную камеру с температурой –40 °С на 2 ч для фиксации структуры. Последующая термическая обработка приводит к выжиганию полимерного каркаса и спеканию керамики. Прочность при сжатии такой керамики — около 5 МПа.

Рентгенофазовый анализ α- и β-ТКФ проводили на дифрактометре Shimadzu XRD 6000 (Япония), используя монохроматическую CuKα радиацию при силе тока 30 мА и напряжении 40 кВ с размером шага 0,01°/с при длине волны λ=1,54 Å. Исследуемые образцы измельчали до порошокообразного состояния.

Образцы для ИК-спектроскопии готовили по стандартной методике на приборе MultiRAM (Германия). Навеску материала 0,02 мг растирали в агатовой ступке до порошкообразного состояния и прессовали в таблетки с 200 мг KBr. Исследование проводили в диапазоне 400—4000 см^-1.

Образцы для сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) клеили на токопроводящий скотч и изучали на приборе VEGA II Tescan (Чехия) при напряжении 15 кВ.

Объектом изучения являлся процесс заживления костных ран эпифиза бедренной кости крыс линии Вистар в разных условиях: в 1-й группе (группа сравнения) костные дефекты оставляли заживать под кровяным сгустком; во 2-й группе (α-ТКФ) в костные дефекты имплантировали блоки α-ТКФ, в 3-й группе (группа β-ТКФ) — пористые блоки β-ТКФ. Под гексеналовым наркозом производили линейный разрез с медиальной стороны эпифиза бедренной кости крыс, затем отслаивали мягкие ткани. С помощью портативной бормашины на малых оборотах (500 об/мин) создавали искусственный костный дефект, диаметром около 2 мм и глубиной 3—4 мм и вводили исследуемый материал. Операционную рану ушивали послойно кетгутом. Сроки оценки заживления костных дефектов составляли 30 сут по 3 животных на срок, включая контроль. Готовили серийные гистологические срезы по стандартной методике с окраской гематоксилином и эозином. Гистологические срезы изучали в проходящем свете на микроскопе Motic Inc. (Италия).

Рентгенофазовый анализ показал, что спектры α- и β-ТКФ имеют различия, характерные для такого типа соединений. Дифрактограммы исследуемых образцов α- и β-ТКФ имели четкие пики, указывающие на высокую степень кристалличности. На рис. 1

ИК-спектры α- и β-ТКФ имеют разные частоты в области поглощения по фосфатным группам ионов, входящих в апатит. На рис. 2

Керамические материалы на основе α-ТКФ состоят из конгломерата мелких гранул (частиц), размером от 100 до 350 мкм. Некоторые из них имеют вид полых образований (рис. 3).

Керамический материал на основе β-ТКФ также состоит из аналогичного конгломерата мелких гранул, размером 100—300 мкм (рис. 5).

По данным зарубежных авторов Cerasorb («Curasan», Германия), ChronOS («Synthes», США) и β-ТКФ («Karios», Франция) также имеют поверхность в виде мелкопористой зернистой структуры [7, 10, 12]. По микроструктурным характеристикам полученная β-ТКФ-керамика схожа с зарубежными материалами (табл. 1).

Заживление костного дефекта под кровяным сгустком, 1-я группа. Через 30 сут от начала опыта в костном дефекте сохранялись обширные территории, занятые грубоволокнистой соединительной тканью. В то же время по краям костного дефекта формировалась трабекулярная костная ткань с фиброзным матриксом. Местами по краям регенерата отмечались участки образования хондроподобной ткани, а также образовывались формирующееся костное вещество с хондроидной тканью и костно-хрящевые структуры (рис. 7).

Заживление костных дефектов при имплантации пористых керамических блоков α-ТКФ, 2-я группа. В костных дефектах после 1 мес наблюдения определяются депозиты α-ТКФ в виде мелких керамических частиц разных форм и размеров, которые образовались в результате распада блока из-за их небольшой прочности. Непосредственно к депозитам α-ТКФ в области входа в дефект прилежат тяжи грубоволокнистой фиброзной ткани с отложениями в некоторых из них базофильных частичек остеоидного вещества. Однако по направлению к центру дефекта удельный вес костной компоненты регенерата постепенно возрастает и становится доминирующим в характеристике регенерата. Небольшое количество грубоволокнистой соединительной ткани определяется в некоторых участках центральной части дефекта. Отмечается прорастание в депозит клеточных элементов, преимущественно макрофагов. Непосредственно к имплантируемому материалу во внутренней части дефекта прилежат отложения остеоидного вещества, которые в виде базофильных включений находятся внутри биодеградируемого материала. Матрикс депозитов α-ТКФ разрежен, что свидетельствует об активной биодеградации. Следует отметить, что непосредственно у краев депозита α-ТКФ, помимо новообразованных костных структур с фиброзно-остеоидным либо остеоидным матриксом, постоянно располагаются небольшие скопления кроветворных клеток. Важной чертой динамики костного регенерата в области депозитов α-ТКФ является то, что костеобразовательный процесс происходит не только между депозитами, но и в них самих, в результате чего их матрикс замещается новообразованным костным веществом фиброзно-остеоидного типа. В глубоких отделах дефекта депозиты α-ТКФ окружены костным матриксом (рис. 8).

Заживление костных дефектов при имплантации пористых керамических блоков β-ТКФ, 3-я группа. В костном дефекте через 1 мес наблюдения определяются депозиты β-ТКФ в виде небольших гранул, которые так же, как в случае с α-ТКФ, образовались в результате распада блока из-за слабой прочности. Кнаружи дефекта имплантируемый материал окружен пучками клеточно-волокнистой соединительной ткани. Внутри гранул депозита можно наблюдать миграцию клеточных элементов с образованием оксифильной остеоидной ткани. Среди клеточно-волокнистых структур видно множество мелких капилляров. Однако в центральном отделе дефекта количество новообразованного костного матрикса значительно возрастает. В некоторых участках биодеградируемые гранулы имеют ячеистую структуру. Наблюдается интенсивное прорастание в депозит клеточных элементов, преимущественно макрофагов, с образованием остеоидной ткани. Клеточные элементы, врастая в депозиты, формируют своеобразные перегородки, которые разделяют их на более мелкие фрагменты. Постепенно происходит трансформация соединительнотканных перегородок в молодую костную ткань, в результате чего мелкие фрагменты легче ассимилируются костными трабекулами. Депозиты, прилежащие к костным трабекулам в зоне контакта, формируют остеоидное вещество.

Керамические частицы, не вовлеченные в процесс биодеградации и находящиеся в среде кроветворной ткани, образуют своеобразный «бордюр» из крупных клеток с оксифильной цитоплазмой, преимущественно макрофагов (рис. 9).

Таким образом, при имплантации в костные дефекты керамики на основе β-ТКФ вокруг и внутри депозита происходят активные регенераторные процессы с присутствием капилляров. Для оценки темпов и выраженности остеоинтеграции депозита в новообразованный костный матрикс важны следующие характеристики костной ткани:

— топография распространения костного регенерата;

— структура костной ткани с точки зрения ее компактности;

— интенсивность развития кроветворной ткани, наличие капиллярной сети в области регенерата.

Костный регенерат развивался главным образом в области депозитов имплантируемого материала в центральных отделах костного дефекта, тогда как в области входа в дефект преобладали соединительнотканные структуры.

Отмечается компактизация костной ткани с преобладанием остеоидного типа строения. Новообразование костной ткани происходит эндесмальным путем, минуя хондроидную стадию развития, что указывает на высокую активность процесса.

В межтрабекулярных пространствах регенерата определяется интенсивное развитие кроветворной ткани с плотным прилеганием к депозитам β-ТКФ. В области регенерата присутствуют многочисленные капилляры.

Гистологический анализ показал, что репаративные процессы в материалах на основе α- и β-ТКФ и их интеграция в костный матрикс в значительной степени зависят от характера поверхности и его микрорельефа, что подтверждается данными СЭМ. Это, по-видимому, связано с тем, что оба материала были получены при разных температурных режимах, α-ТКФ — при высоких температурах, а β-ТКФ — при низких. Необходимо отметить, что α-ТКФ имеет большую растворимость, а β-ТКФ — меньшую [2]. Несмотря на то что характер упаковки зерен, их форма и размеры слаборазличимы, явные перспективы имеет керамический материал с низкой температурой спекания, что находит отражение в остеоинтеграционных процессах.

Как отмечают S. Choi и соавт. (2012), решающее влияние на остеоинтеграционные процессы оказывают дизайн материала и архитектоника поверхности [8]. Так, полученный ими материал β-ТКФ в форме тетрапода по количеству новообразованной костной ткани статистически достоверно превосходил β-ТКФ в гранулированном виде (Osferion).

В наших исследованиях дизайн образцов α- и β-ТКФ не различался, но сильно различался характер поверхности.

Процесс биодеградации материала на основе β-ТКФ происходил с активным участием кроветворной ткани и капилляров, тогда как у α-ТКФ эти процессы были выражены слабее. У депозитов с α-ТКФ определялось наличие грубоволокнистой ткани в центральных отделах дефекта, тогда как у β-ТКФ она отсутствовала.

Важным фактором различия регенераторных процессов является то, что депозиты блока α-ТКФ в глубоких отделах дефекта окружены со всех сторон костной тканью, тогда как депозиты блока β-ТКФ уже включены в костный матрикс.

Гистологическая оценка остеопластических свойств исследуемых материалов. Морфометрический анализ. Для оценки темпов остеоинтеграции депозитов α- и β-ТКФ в новообразованный костный матрикс определяли указанные выше параметры. Как показал статистический анализ, по количеству новообразованной костной ткани вокруг депозитов α- и β-ТКФ достоверно не различались (рис. 10).

Таким образом, изучение пористых керамических блоков α- и β-ТКФ показало, что различия в способе изготовления влияют на характер поверхности материала, что обусловливает различия в остеоинтеграционных процессах в костной ткани. Преимущество имеет материал с более низкой температурой спекания, в данном случае β-ТКФ, несмотря на то, что гистоморфометрический анализ не выявил его статистически достоверного отличия от α-ТКФ. Следует добавить, что данные материалы, обладая такой пористой поверхностью, могут быть пригодными в качестве неорганических матриксов для тканеинженерных конструкций.

Работа поддержана Программой Президента РАН.