Введение

В современном акушерстве и гинекологии вопросы сохранения и реализации репродуктивной функции имеют не только медицинское, но и социально-экономическое значение. В настоящее время государство принимает активное участие в улучшении качества здоровья населения и разрабатывает эффективные меры по повышению рождаемости. Согласно данным Федеральной службы государственной статистики, в России число родившихся на 1000 человек населения увеличилось с 10,2 в 2005 г. до 10,9 в 2018 г. И, несмотря на снижение общего числа женщин репродуктивного возраста с 39 400 тыс. в 2005 г. до 34 794 тыс. в 2018 г., число женщин, закончивших беременность родами в срок за этот период, увеличилось с 1238,3 до 1370,2 тыс. Положительная динамика отмечается и в снижении количества абортов с 1675,5 тыс. в 2005 г. до 661,0 тыс. в 2018 г. и, что особенно важно, преждевременных родов и материнской смертности, динамика которых с 2015 г. оставалась стабильно высокой [1—3].

Однако, несмотря на активные меры по преодолению демографического кризиса, показатели естественного прироста населения в России, к сожалению, продолжают снижаться, и одной из причин этого являются непредотвратимые репродуктивные потери [4]. Так, в Российской Федерации в 2018 г. на 1370,2 тыс. родов пришлось 102,3 тыс. самопроизвольных абортов и 65,9 тыс. преждевременных родов [5].

Решающими факторами, во многом определяющими увеличение количества осложнений беременности и родов, являются такие, как возраст, рост количества соматической патологии и заболеваний репродуктивной системы [6, 7]. Так, в Астраханской области на фоне снижения численности женщин фертильного возраста (15—49 лет) за период 2009—2020 гг. с 272 902 до 237 358 человек, в том числе активного репродуктивного (20—29 лет) — с 89 513 до 65 043, отмечено увеличение среднего женского возраста — 40,7 года и коэффициента рождаемости в возрастных группах с повышенным риском экстрагенитальной и акушерско-гинекологической патологии: в возрасте 25—29 лет — на 34% (с 79,5 до 120,3‰), 30—34 года — на 46,9% (с 43 до 81‰), 35—39 лет — на 64,9% (с14,5 до 41,3‰), 40—44 года — на 72,7% (с 2,4 до 8,8‰) [8, 9].

В течение последних 20 лет ВОЗ ведет активную работу, направленную на улучшение репродуктивного здоровья населения, в которой одним из направлений является координация научных исследований широкого практического применения, сфокусированных на улучшении здоровья матерей во время беременности, родов и в послеродовом периоде [10—12].

Рост частоты репродуктивных потерь и долгосрочных осложнений, связанных с преждевременными родами, требует поиска эффективных методов доклинической диагностики и прогнозирования исходов беременности.

В практической медицине все более широкое применение находит метод диагностики патологических состояний организма человека, основанный на морфологическом анализе структур дегидратированных капель биологических жидкостей (БЖ) [13, 14].

Долгое время изучение БЖ в связи с высокой динамичностью их молекулярного состава ограничивалось определением качественного и количественного состава их элементов. В настоящее время российскими учеными С.Н. Шатохиной и В.Н. Шабалиным [15, 16] разработаны и внедрены в медицинскую практику методики перевода БЖ в твердую фазу, имеющие не только большое научное, но и практическое значение.

При переходе жидкости в твердую фазу в результате дегидратации формируется тонкая пленка высыхающей капли — фация*, и создаются условия для анализа структур БЖ. Фация — это своего рода структурный макропортрет, отражающий физиологические и патофизиологические процессы, протекающие в БЖ. При нормальных условиях в БЖ существует определенный порядок, который обеспечивается структурами с соответствующими качественными и количественными параметрами. При патологических состояниях наблюдаются значительные нарушения данного порядка, выражающиеся в потере БЖ способности формировать физиологические структуры. В результате структуры приобретают новые признаки, которые рассматриваются как патологические [17—19]. Фация дегидратированной капли БЖ, в частности сыворотки крови, по своему информационному содержанию может быть приравнена к структуре гистологического среза и имеет характерную для каждого случая морфологическую картину, отражающую физиологические или патологические процессы в организме [20, 21].

Изучение БЖ возможно методом как клиновидной, так и краевой дегидратации.

При краевой дегидратации каплю исследуемой БЖ помещают на поверхность подложки (предметного стекла) и покрывают специальным тонким (покровным) стеклом. Создается аналитическая (оптическая) ячейка, в которой происходит медленное (в течение 24—72 ч) испарение воды и создаются оптимальные условия для роста кристаллов. Формы кристаллов определяются волновым (вибрационным) градиентом между кристаллообразующими элементами и элементами окружающей среды. Конфигурация и положение кристаллов дают исследователю интегрированную информацию о количественном и качественном составе органических и неорганических веществ в БЖ [21]. Информационными критериями служат морфотипы, формирующиеся структуры, количество образующихся кристаллов, их распределение по размерам, цветности, а также площадь кристаллообразования. Все перечисленные и другие параметры оцениваются с помощью поляризационно-оптических и поляризационно-фотометрических методов. Сформированные кристаллические структуры являются изотропными и хорошо просматриваются при обычной микроскопии [15, 21]. Основными базисными структурами краевой дегидратации сыворотки крови здоровых лиц служат средние и крупные сферолиты, папоротникообразные и переходные структуры [18]. Патологические структуры формируются в результате изменения количественного и качественного состава растворенных в БЖ органических молекул. Так, формирующим материалом для многих пластинчатых структур — маркеров воспалительного процесса и деструкции клеток — является холестерин [21]. Параллельные трещины — маркеры усиленной пролиферации — образуются преимущественно в краевой зоне за счет фибрина или лецитина и определяются при гиперпластических процессах и беременности [21]. Ветвистые дендриты — результат скопления липидов и триглицеридов. Паутинообразные структуры характерны для выраженной гипоксии органов и тканей [15, 21].

Цель исследования — оценка возможности применения метода краевой дегидратации сыворотки крови для прогнозирования и ранней диагностики репродуктивных потерь.

Материал и методы

Все пациентки были информированы и дали согласие на участие в исследовании. План и методика сбора биоматериала были утверждены региональным независимым этическим комитетом (заседание РНЭК от 18.10.16, протокол №3).

В исследование были включены 40 пациенток с клиническими проявлениями самопроизвольного аборта в сроках от 5 до 8 нед гестации (1-я группа) и 41 пациентка с диагнозом «неразвивающаяся беременность» (2-я группа). Контрольную группу составили 36 пациенток аналогичного срока беременности (5—8 нед) с ее физиологическим течением.

Критерии исключения из исследования: тяжелые экстрагенитальные заболевания, миома матки, подтвержденный патологический кариотип плода, эндокринный и антифосфолипидный генез невынашивания беременности, а также беременности в результате применения программы ЭКО.

Во всех обследуемых группах проводили общий и гинекологический осмотры, стандартное лабораторное обследование, а также гистологическое исследование хориона после самопроизвольного аборта и неразвивающейся беременности. Для метода краевой дегидратации использовали аналитическую (оптическую) ячейку, которую формировали путем нанесения 0,2 мл сыворотки венозной крови, полученной в результате цетрифугирования в течение 5 мин при скорости 3000 оборотов в 1 мин, на поверхность предметного стекла и накрывали покровным стеклом. Анализ кристаллических структур дегидратированной капли сыворотки крови в аналитических ячейках проводили после высушивания в течение 72 ч при температуре 20—24 °C путем поляризационно-оптической микроскопии с использованием стереомикроскопа Leica M80. При изучении фации БЖ использовали программу обработки и анализа изображений Image Pro Plus 6 фирмы «Media Cybernetics».

Одновременно в сыворотке крови обследуемых групп проводили оценку биохимических маркеров беременности — трофобластического бета-1-гликопротеина (ТБГ) и гормона — хорионического гонадотропина человека (ХГч) по стандартным методикам с использованием метода иммуноферментного анализа (ИФА).

Описание количественных признаков при нормальном или близком к нормальному распределению представлено в виде M±m, где M — выборочная средняя величина, m — ошибка средней арифметической. Качественные признаки описывали в процентах (%) и абсолютных значениях (n).

При сравнении средних значений в группах использовали непараметрический критерий Манна—Уитни и параметрический t-критерий Стьюдента. Связь между количественными показателями оценивали с помощью рангового коэффициента корреляции Спирмена (r). Различия считали статистически значимыми при p<0,05. Статистическая обработка результатов выполнена с использованием пакета программ Statistica 6.0 («StatSoft, Inc.», США).

Результаты

Средний возраст пациенток составил 29,5±0,6 года (p>0,05). Из общего числа пациенток у 77 (65,8%) беременность наступила впервые. Анализ репродуктивной функции и гинекологической патологии у женщин обследованных групп представлен в табл. 1.

Таблица 1. Особенности репродуктивной функции и гинекологической патологии пациенток обследованных групп

Примечание. * — различия показателей статистически значимы по сравнению с таковыми контрольной группы, p<0,05. НБ — неразвивающаяся беременность.

В ранние сроки беременности ХГч и ТБГ часто используют как биомаркеры прогнозирования исходов беременности [22]. ХГч является важным гормоном беременности. Клиническая значимость уровня ХГч в сыворотке крови связана не только с его появлением и ростом в ранние сроки беременности, но и с количественным изменением во время беременности и связанных с беременностью осложнений [23]. Уровни ХГч могут широко варьировать у женщин с нормальной беременностью. Обычно концентрация ХГч в сыворотке крови и моче экспоненциально возрастает в I триместре, удваиваясь примерно каждые 24 ч на протяжении первых 8 нед. Пик приходится на 10 нед беременности, а затем уровень ХГч снижается и со срока 16 нед гестации остается относительно постоянным. Пациентки, у которых уровень ХГч достигает максимума к 8 нед и не увеличивается, как правило, имеют нежизнеспособную или эктопическую беременность [22, 23].

ТБГ — специфический белок беременности (белок «зоны беременности»), синтезируемый клетками цито-, синцитиотрофобласта, плацентой и секретируемый в кровоток матери. Впервые ТБГ был обнаружен в сыворотке крови рожениц, затем выделен из экстрактов плаценты. Установлено, что одним из физиологических эффектов является его иммуносупрессивное действие: препятствует отторжению плодного яйца материнским организмом; кроме того, регулирует рост и пролиферацию клеток плаценты и трофобласта, что необходимо для нормального развития беременности. Концентрация ТБГ увеличивается пропорционально сроку беременности [23].

При определении уровня ТБГ и ХГч в сыворотке крови обследуемых групп было установлено статистически значимое различие между показателями (табл. 2).

Таблица 2. Уровни трофобластического бета-1-гликопротеина и хорионического гонадотропина человека в сыворотке крови (M±m)

Примечание. * — различия статистически значимы по сравнению с таковыми контрольной группы, p<0,05.

Методом краевой дегидратации с помощью обычной микроскопии в оптических ячейках сыворотки крови у женщин с нормально протекающей беременностью достоверно чаще определялись «переходные» структуры (p=0,041) и непрерывные, длинные (5—7 мм) параллельные трещины — маркеры гиперплазии и усиленной пролиферации (p=0,021) (рис. 1). В ячейках сыворотки крови пациенток 1-й группы с самопроизвольным выкидышем отмечалось нарушение группировки параллельных трещин, уменьшение их длины до 3 мм (p=0,016) (рис. 2). В ячейках сыворотки крови пациенток с неразвивающейся беременностью (2-я группа) встречались лишь отдельные единичные фрагменты параллельных трещин (p=0,023), а также паутинообразные структуры (p=0,028). Папоротникообразные и переходные структуры при этом виде патологии не визуализировались (p=0,028) (рис. 3).

Рис. 1. Фрагмент аналитической (оптической) ячейки сыворотки крови женщины с прогрессирующей беременностью, ×100.

а — параллельные трещины; б — переходные структуры.

Рис. 2. Фрагмент аналитической (оптической) ячейки сыворотки крови пациентки с самопроизвольным абортом, ×100.

а — нарушение группировки и целостности параллельных трещин.

Рис. 3. Фрагмент аналитической (оптической) ячейки сыворотки крови пациентки с неразвивающейся беременностью, ×100.

а — остаточные единичные фрагменты параллельных трещин.

Согласно результатам исследования, в контрольной группе преобладали дендритные и переходные структуры как вариант нормы (p<0,05). При неразвивающейся беременности наиболее часто встречались паутинообразные, пластинчатые и комбинированные структуры (p<0,05).

Структурные элементы твердой фазы сыворотки крови пациенток обследованных групп, выявленные с помощью обычной световой микроскопии, представлены в табл. 3.

Таблица 3. Структурные элементы твердой фазы сыворотки крови пациенток обследованных групп

Примечание. * — различия статистически значимы по сравнению с таковыми контрольной группы, p<0,05.

Установлена инициирующая положительная корреляция между уровнем гормона ТБГ в сыворотке крови при неразвивающейся беременности и нарушением структуропостроения в аналитической ячейке — преобладанием пластинчатых, паутинообразных и комбинированных структур и наличием лишь единичных фрагментов параллельных трещин.

Сильная корреляция также установлена между уровнем ТБГ и переходными структурами у пациенток с физиологическим течением беременности.

Использование корреляционного анализа позволило установить инициирующую положительную корреляцию между уровнем гормона ТБГ в сыворотке крови при неразвивающейся беременности (2-я группа) и нарушением структуропостроения в аналитической ячейке параллельных трещин (r=0,73; p<0,05).

Сильная корреляция также выявлена между уровнем ТБГ и переходными структурами (r=0,81; p<0,05) у пациенток с нормальным течением беременности. При оценке уровня ХГч в сыворотке крови обследованных групп не выявлено статистически достоверной корреляции с патологическими структурами.

В случае прогрессирования беременности на фоне курса терапии, направленной на ее пролонгирование, в аналитических ячейках определялось значительное увеличение количества групп длинных, неразорванных параллельных трещин, что не отмечалось при неблагоприятном исходе беременности (p=0,012).

Заключение

Согласно работам С.Н. Шатохиной и В.Н. Шаболина, при краевой дегидратации БЖ создаются оптимальные условия для локальной самоорганизации. Гармоничный порядок трещин, характерный для фаций сыворотки крови здоровых людей, при патологических состояниях приобретает хаотичное расположение, при этом степень нарушения расположения трещин соответствует тяжести патологии.

Полученные результаты исследования свидетельствуют, что при патологическом варианте развития беременности в аналитической ячейке происходит формирование таких структур, как паутинообразные и пластинчатые, что может служить отражением гипоксии клеток, их деструкции и гибели. Кроме того, при неразвивающейся беременности отмечается нарушение процессов усиленной пролиферации структур, характерных для прогрессирующей беременности, что проявляется в структуре формирования параллельных трещин.

Таким образом, метод краевой дегидратации является простым в исполнении, позволяет на малых объемах БЖ проводить оценку состояния гомеостаза беременной. Одновременное применение биохимических методов исследования в виде определения уровня ТБГ и структурного анализа сыворотки крови методом краевой дегидратации в ранние сроки беременности позволяет проводить оценку эффективности лечения при угрожающем самопроизвольном аборте и прогнозировать исходы беременности.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — О.Г. Тишкова, А.К. Аюпова

Сбор и обработка материала — О.Г. Тишкова, А.К. Аюпова

Статистическая обработка данных — О.Г. Тишкова

Написание текста — О.Г. Тишкова, А.К. Аюпова, Л.В. Дикарева

Редактирование — Л.В. Дикарева, А.К. Аюпова

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Participation of authors:

Concept of the study — O.G. Tishkova, A.K. Ayupova

Collecting and processing of data — O.G. Tishkova, A.K. Ayupova

Statistical processing of the data — O.G. Tishkova

Text writing — O.G. Tishkova, A.K. Ayupova, L.V. Dikareva

Editing — L.V. Dikareva, A.K. Ayupova

Authors declare lack of the conflicts of interests.

---

*Facies (лат.) — внешний вид, наружность, внешность.