Введение

В настоящее время не вызывает сомнения, что развитие гестации, течение пре- и постнатального периодов в значительной степени определяются состоянием метаболических процессов в системе мать—плацента—плод. Причем в этой биологической системе важная роль принадлежит плаценте, обеспечивающей взаимосвязь организмов матери и плода [1, 2]. Дисфункция плаценты (плацентарная недостаточность — ПН) является одной из первостепенных проблем акушерства, поскольку представляет собой одну из серьезных причин высокой перинатальной заболеваемости и смертности. С данной патологией связаны до 20% случаев перинатальной смерти [3, 4].

В сложной цепи нарушений в плаценте при ее дисфункции большое значение может иметь модификация баланса между анаболизмом и катаболизма белков, так как именно белки играют ключевую роль в регуляции многочисленных молекулярно-биохимических процессов, что позволяет им реализовывать информационную программу клеток [5]. В то же время, если белоксинтезирующие реакции в плаценте в определенной степени изучены [6, 7], то сведения о процессах деструкции белков весьма незначительны [8]. Распад белковых молекул осуществляется с помощью протеолитических ферментов — пептидгидролаз, активность которых зависит от оптимума pH реакции, а также от их субклеточной локализации [9, 10]. Гидролитическое расщепление белков разных клеточных структур, выполняющих многочисленные специфические функции, расширяет спектр негативных последствий деструкции белков с различными свойствами: регуляторными, транспортными, пластическими, гормональными [11], что отражается на гомеостазе не только плаценты, но и всего фетоплацентарного комплекса.

С учетом изложенного и малочисленности данных о характере деструктивных повреждений плацентарных белков целью работы явилось изучение активности пептидгидролаз в субклеточных фракциях плаценты при нарушении ее функции.

Материал и методы

В исследование были включены 60 беременных в возрасте 24—30 лет. Контрольную группу составили 28 клинически здоровых женщин с неосложненным течением беременности и родов. Основная группа включала 32 пациентки, беременность которых осложнилась дисфункцией плаценты, верифицированной после родов. По возрасту, индексу массы тела, соматическому, акушерско-гинекологическому анамнезу, паритету беременностей и родов женщины обеих групп были сопоставимы. В обеих группах преобладали первородящие женщины: в основной группе они составили 62,5%, в контрольной — 60,7%. В анамнезе прерывание беременности по желанию женщины было в 21,9 и 23,6% наблюдений соответственно в основной и контрольной группах. Самопроизвольные выкидыши у всех пациенток отсутствовали. Наличие хронических заболеваний имелось в 18,8 и 17,7% наблюдений.

Из исследования исключали пациенток с инфекционными заболеваниями, декомпенсированными формами соматических заболеваний, многоплодной беременностью, аутоиммунной патологией, признаками преэклампсии, задержки роста плода и не давших информированного согласия на участие в исследовании.

Проведение исследования одобрено локальным этическим комитетом.

Диагноз ПН был поставлен на основании результатов комплексного функционально-биохимического динамического обследования. Критериями при постановке диагноза (и для включения в основную группу) служили снижение маточно-плацентарного или плодово-плацентарного кровотока без признаков централизации кровообращения при допплерометрии, признаки гипоксии при кардиотокографии, снижение активности специфического плацентарного изофермента глутаматдегидрогеназы в крови, снижение уровня плацентарного лактогена и эстрадиола, уменьшение содержания гуанина — биохимического маркера тканевой гипоксии.

Скрининговое ультразвуковое исследование с допплерометрией проводили в сроки 30—34 нед (в соответствии с приказами МЗ РФ), при выявлении нарушений кровотока осуществляли динамический допплерометрический и кардиотокографический контроль за состоянием плода до момента родоразрешения. Измерение показателей кровотока проводили трехкратно в правой и левой маточной артерии, в обеих артериях пуповины, правой и левой средней мозговой артерии. Для количественной оценки кривых скоростей кровотока использовали пульсационный индекс (ПИ). Нарушения кровотока в маточных артериях и артериях пуповины констатировали при ПИ больше 95-го перцентиля нормативных значений ПИ в зависимости от срока беременности, а в средней мозговой артерии плода — при ПИ менее 5-го перцентиля нормативных показателей. Критериями постановки диагноза дисфункции плаценты явились умеренные нарушения кровотока, соответствующие нарушению гемодинамики I степени по классификации А.Н. Стрижакова (1988) [4].

Отставание роста у плодов по показателям ультразвуковой фетометрии отсутствовало. Микроскопические исследования, проведенные на парафиновых препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином (использован микроскоп Nikon Eclipse 80i), выявили в плацентах женщин основной группы патологические изменения: наличие участков кальциноза, фиброза, повышение количества фибриноида, гиперваскуляризацию ворсин, мелкие межворсинчатые кровоизлияния, увеличение зоны тромбоза межворсинчатого пространства. Выявленный признак считали положительным, если был отмечен более чем в 5 полях зрения при анализе 10 полей при увеличении микроскопа ×100.

Анализ исходов родов в основной группе показал, что средняя масса тела и рост новорожденных, составившие 3511±285,43 г и 51,75±1,99 см соответственно, весоростовой коэффициент — 67,85±2,92 статистически значимо не отличались от таковых в контрольной группе (3467±297,21 г и 52,48±2,07 см, весоростовой коэффициент — 66,06±3,19), что сочеталось с данными ультразвуковой фетометрии. Дети основной группы родились в состоянии асфиксии средней степени тяжести, оценка состояния по шкале Апгар составила 4—6 баллов, отмечены явления дыхательной недостаточности различной степени выраженности и метаболического ацидоза. Последнее может быть связано с нарушением компенсаторно-приспособительных механизмов метаболического характера на тканевом, клеточном и субклеточном уровнях плаценты. У 12 новорожденных имелись цианоз кожных покров и приглушенность тонов сердца. В контрольной группе все новорожденные были клинически здоровыми, оценка состояния по шкале Апгар при рождении составила 8—10 баллов. В постнатальном периоде у 35% детей основной группы женщин (в отделении патологии новорожденных и недоношенных детей) была диагностирована постнатальная гипоксическая ишемическая энцефалопатия, характеризующаяся патологическим повышением проницаемости гематоэнцефалического барьера, что приводило к увеличению в крови на 7-й день после рождения содержания нейроспецифической енолазы, являющейся информативным тестом выявления церебральных повреждений.

Обследованные пациентки наблюдались в амбулаторно-консультативном отделении НИИ акушерства и педиатрии ФГБОУ ВО «РостГМУ» Минздрава России в рамках программы «Акушерский мониторинг». Проведение исследования одобрено локальным этическим комитетом НИИАП.

Материалом для исследования служила ткань плаценты. Образцы плаценты получали сразу после родов при соблюдении холодового режима (t=+2...+4 °C). Для исследования брали центральную часть макроскопически нормальных участков плаценты, включая плодовую и материнскую поверхности, не затрагивая крупных сосудов. Вырезанные образцы (10 г) промывали охлажденным изотоническим раствором натрия хлорида для удаления остатков крови и амниотической жидкости, затем гомогенизировали (при t=+4 °C) в 0,25 М растворе сахарозы, 5 мМ MgCl₂, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ Трис-HCl (pH 7,4) в присутствии ингибиторов протеаз с помощью гомогенизатора Ultra-Turrax («IKA», Германия). Затем методом дифференциального центрифугирования (центрифуга Avanti J-30I «Beckman Coulter», США) последовательно выделяли фракцию ядер (осадок, 1000 × g, 15 мин при +4 °C), митохондрий (осадок, 12 тыс. × g, 20 мин при +4 °C) и цитоплазму (супернатант после центрифугирования при 105 тыс. × g, 60 мин при +4 °C). Мембранную фракцию получали методом дифференциального центрифугирования, разработанным для микроворсин плацентарной ткани — наиболее удобного объекта для изучения плазматических мембран [12].

Активность пептидгидролаз (КФ 3.4.4) определяли по степени нарастания растворимых в трихлоруксусной кислоте фолин-положительных соединений после инкубации проб исследуемого объекта с буферными растворами (pH 3,6 и 7,1) и экзогенными белками-субстратами: 1% растворами гемоглобина и альбумина соответственно для кислых и нейтральных пептидгидролаз. Для построения калибровочной кривой использовали стандартные растворы тирозина.

Определение границ молекулярных масс продуктов деструкции белков пептидгидролазами проводили методом гель-хроматографии на колонке сефадекса G-25, через которую пропускали безбелковые центрифугаты, полученные после окончания инкубации. Колонка была предварительно откалибрована маркерами с известными молекулярными массами от 100 000 дальтон (пептиды) до 181 дальтона (свободный тирозин).

Статистическую обработку данных осуществляли с помощью лицензионного пакета программ Statistica (версия 6.0 фирмы «StatSoft Inc.»). Оценка характера распределения данных с помощью критерия Шапиро-Уилка свидетельствует об их нормальном распределении. Данные представлены в виде среднего значения (M) и средней квадратичной ошибки (m). Статистическую значимость различий между сравниваемыми показателями определяли по критерию Стьюдента (t-критерий) для независимых выборок. Результаты оценивали как статистически значимые при p<0,05.

Результаты и обсуждение

Проведенные исследования свидетельствуют об изменении активности протеолитических процессов в плаценте при ее функциональной недостаточности по сравнению с аналогичными показателями в контрольной группе (см. таблицу). Активность как кислых, так и нейтральных пептидгидролаз в различной степени повышается во всех субклеточных фракциях. Обращает внимание, что максимальная абсолютная активность обоих типов ферментов наблюдается в цитоплазме, затем в убывающем порядке следуют митохондрии, мембраны и ядра. В то же время степень изменения активности кислых и нейтральных пептидгидролаз в разных субклеточных фракциях при осложненной беременности различна. Так, активность ферментов, действующих в кислой среде, в наибольшей степени повышена в митохондриях (на 38,1%; p<0,001), а в цитоплазме увеличение составляет лишь 28,6% (p<0,01). При нейтральном pH максимальное увеличение активности пептидгидролаз, напротив, наблюдается в цитоплазме (на 39,2%; p<0,01), в митохондриях и клеточных мембранах активность нейтральных протеолитических ферментов повышена на 29,8% (p<0,01) и на 22,3% (p<0,01) соответственно. В меньшей степени активность возрастает в ядрах: при pH 3,6 повышение составляет 17,7%, а при pH 7,1—18,7% (p<0,05 в обоих случаях).

Таблица. Активность пептидгидролаз (мкмоль/мг белка) в субклеточных фракциях плаценты при физиологической беременности и при дисфункции плаценты (M±m)

Примечание. Достоверность различий относительно контрольных величин: * — p<0,05;** — p<0,01; *** — p<0,001.

Для выяснения характера модификации белков под действием пептидгидролаз необходимо иметь представление о природе продуктов деструкции. Анализ кислоторастворимых фрагментов ферментативного расщепления плацентарных белков показал, что наиболее высокомолекулярные из них образуются главным образом при действии кислых пептидгидролаз. Протеолитические ферменты, активные при pH 7,1, в большей степени продуцируют свободные аминокислоты и низкомолекулярные пептиды. По-видимому, кислые пептидгидролазы осуществляют начальные этапы расщепления белков, а образующиеся при этом крупные пептиды могут служить субстратами для пептидгидролаз, действующих при нейтральных значениях pH.

Усиление интенсивности деструктивных повреждений белков при дисфункции плаценты, несомненно, приводит к значительным изменениям в структуре и свойствах белков субклеточных фракций. Причем наряду с определенными общими функциями белковых молекул имеется специфика в механизмах клеточной регуляции в различных субклеточных фракциях. Учитывая функции митохондрий, можно полагать, что значительное повышение гидролитической деструкции их белков под действием пептидгидролаз, активных как в нейтральной, так и особенно в кислой среде, будет нарушать процессы клеточного дыхания и снижать энергетический резерв плацентарной ткани. Поскольку кислые пептидгидролазы вызывают глубокую деструкцию белков, их негативные эффекты весьма значимы.

Нейтральные пептидгидролазы приводят к существенной активации расщепления белков цитоплазмы, большое значение для функций которой имеют входящие в ее состав специфические белки беременности, обладающие иммуносупрессивными свойствами, позволяющими выживать чужеродному по антигенам плоду в организме матери [13]. Цитоплазматические белки составляют более 30% белкового фонда плаценты. Даже повреждение боковых цепей аминокислотных остатков, не затрагивающее более глубокие участки белковой молекулы, характерное для нейтральных пептидгидролаз, очевидно, отрицательно влияет на регуляторные возможности указанных белков, способствуя нарушению гомеостаза в фетоплацентарном комплексе.

Повреждение плазматических и других мембран плаценты, в которых локализован ряд белков, обеспечивающих активный транспорт, контактные взаимодействия, рецепцию биоактивных соединений, пространственное разобщение и другие жизненно важные процессы в клетке, не может не повлиять на их осуществление. Причем в деструкции мембранных структур при дисфункции плаценты примерно в одинаковой степени задействованы и кислые, и нейтральные пептидгидролазы, т.е. расщепление белковых молекул в мембранах происходит на уровне концевых участков и более глубоких структур полипептидной цепи. Кроме того, повреждения весьма лабильных мембран лизосом, отличающихся особенно высоким содержанием кислых ферментов [14, 15], способствуют их дополнительному выходу из данной субклеточной фракции в цитоплазму и усилению повреждающего действия на цитоплазматические белки.

Увеличение активности протеолитических процессов при дисфункции плаценты в меньшей степени обнаружено для ядерных белков, включающих гистоны и негистоновые белки хроматина, которые участвуют в формировании его структуры, подготовке тканей к митозу, регуляции экспрессии генов. Модуляция биологической активности ДНК под действием ядерных белков нарушает пролиферативные процессы, высокая активность которых характерна для плацентарной ткани [16, 17]. Кроме того, уменьшение содержания негистонов (как следствие повышения активности ядерных пептидгидролаз), являющихся акцепторными участками хроматина для стероидрецепторных комплексов [18], может способствовать гормональному дисбалансу в фетоплацентарной системе. Приведенные функции ядерных белков подчеркивают, что даже небольшие их изменения будут сопровождаться глубокими повреждениями на транскрипционном уровне регуляции протеосинтеза.

Гидролитическая деструкция белков, несомненно, изменяет их свойства, что подтверждают ранее проведенные нами исследования посттрансляционной модификации белков [19]. В свою очередь по принципу обратной связи предварительная физико-химическая модификация белковых молекул, в том числе окислительная деструкция, наблюдающаяся при плацентарной недостаточности [20], сопровождается повышением чувствительности белков к действию пептидгидролаз.

Важно также отметить, что понижение устойчивости даже незначительно модифицированных белков к протеолитическим воздействиям значительно усугубляет метаболическую ситуацию. «Дефектные» белки будут продолжать участвовать в межклеточной коммуникации, получении и передаче сигнальной информации из окружающей среды в искаженном виде, нарушая тем самым многочисленные регуляторные процессы. Это позволяет полагать, что в определенных условиях деструкция таких белков может иметь компенсаторный характер, устраняя поврежденные белки из общего каскада реакций обмена веществ.

Заключение

Резюмируя полученные данные, можно заключить, что при дисфункции плаценты происходит усиление гидролитического распада белков субклеточных фракций плаценты. Степень модификации структуры белков зависит от субклеточной локализации, pH реакции (кислой или нейтральной), природы продуктов расщепления белков (пептидов или свободных аминокислот). Для кислых пептидгидролаз максимальные изменения возникают в митохондриях и мембранах, для нейтральных — в цитоплазме. В ядрах деструкция белков при обоих значениях pH менее выражена, чем в других фракциях. Взаимодействие всех этих повреждений приводит к выраженной разносторонней модификации свойств белков и, следовательно, их функциональной активности. Выявленные изменения, охватывающие различные уровни структуры белков, могут быть важными звеньями в цепи молекулярных повреждений в плаценте при ее дисфункции.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Т.Н. Погорелова

Сбор и обработка материала — А.А. Михельсон, В.О. Гунько, Н.В. Палиева

Статистическая обработка данных — В.О. Гунько

Написание текста — Т.Н. Погорелова

Редактирование — Т.Н. Погорелова, В.О. Гунько

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.