Введение

Среди множества причин, вызывающих осложнения беременности, особое внимание уделяется эндокринопатиям матери, в частности, заболеваниям щитовидной железы (ЩЖ) и сахарному диабету (СД) в связи с тем, что беременность является фактором дополнительной стимуляции ЩЖ и поджелудочной железы [1—7]. В большей степени способствуют развитию осложнений беременности и часто встречающиеся виды акушерской патологии: гестационный СД и преэклампсия [8—13]. Нами впервые показано, что исследование системы мать—плацента—плод при эндокринопатиях и акушерской патологии с помощью атомно-силовой микроскопии позволяет изучать рельеф поверхности измененных клеток и клеточные мембраны на наноскопическом уровне, выявлять структурные особенности тканей, в частности, ворсин хориона плодовой части плаценты и миометрия, а также структуру рельефа эритроцитов, часто изменяющихся при данных заболеваниях, что приводит к нарушению тканевого дыхания [14—20].

В связи с этим целью данного исследования явилось изучение структурных особенностей тканей плаценты, пуповины и матки, а также эритроцитов системы мать-плацента-плод при беременности на фоне патологии ЩЖ различного генеза, СД 1-го типа и гестационного сахарного диабета (ГСД), преэклампсии умеренной и тяжелой степени.

Материал и методы

Обследование, лечение и родоразрешение 117 беременных проводилось на базе Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа (Белгород) и Московского областного НИИ акушерства и гинекологии (Москва). Морфологические и биохимические исследования выполнялись на кафедре патологии медицинского института Белгородского государственного национального исследовательского университета (НИУ БелГУ), а также в Научно-образовательном и инновационном центре «Наноструктурные материалы и технологии» НИУ БелГУ.

Обследуемые пациентки были включены в следующие группы:

1-я группа — 25 беременных с эутиреоидным состоянием при наличии патологии ЩЖ— гипертрофии ЩЖ I—II степени, смешанного зоба;

2-я — 20 беременных с гипотиреозом — послеоперационным гипотиреозом, аутоиммунным тиреоидитом, врожденным гипотиреозом;

3-я — 20 беременных с диффузным токсическим зобом (ДТЗ);

4-я — 12 беременных с СД 1-го типа;

5-я — 15 беременных с ГСД;

6-я — 15 беременных с преэклампсией: 5 — с преэклампсией тяжелой степени, 10 — с умеренной преэклампсией. Группу сравнения (7-ю) составили 10 произвольно отобранных беременных без эндокринопатий и диагностированной соматической и акушерской патологии.

Проводили изучение акушерского анамнеза, сопутствующей экстрагенитальной патологии, течения беременности и родов. Наряду с общепринятыми в акушерской практике клиническими и лабораторными методами обследования был включен ряд специальных методов. Так, были проведены исследование ЩЖ с помощью ультразвукового метода на аппарате «Aloka-5500», а также дополнительные лабораторные исследования (определение трийодтиронина, общего и свободного тироксина, тиреоидного гормона и антител к тиреоглобулину). Выполнено определение уровня глюкозы в плазме крови, в том числе с нагрузкой. Осуществлено также общепринятое клиническое обследование новорожденных.

Проводили забор биопроб тканей плаценты (ворсинчатого хориона), пуповины и стенки матки из области поперечного разреза ее нижнего сегмента во время кесарева сечения для атомно-силовой и световой микроскопии. После анализа окрашенных гематоксилином и эозином срезов выбирали необходимые блоки, которые просматривали, фотографировали, изучали с помощью морфометрического анализа в приборе «Ntegra-Aura». Помимо этого система позволяет просмотр необработанного материала непосредственно после забора или зафиксированного в нейтральном формалине, но без парафиновых блоков. Работу выполняли в контактных режимах прерывистого, а также постоянного профиля с применением Si- или SiN-кантилеверов, с использованием низкого вакуума атмосферы. Анализ и исполнение атомно-силовых изображений делали с применением стандартного программного обеспечения NOVA («НТ-МДТ») и ImageAnalysis («НТ-МДТ»).

Помимо этого было проведено исследование эритроцитов. Осуществляли забор образцов крови, а затем приготовление образцов из суспензии эритроцитов, предварительно отмытых от плазмы. После этого образцы размещали на обезжиренном предметном стекле для иммуногистохимического анализа и располагали во влажной камере «Ntegra-Aura» для проведения сканирования. Использование способа позволяет сократить время исследования и получать сканы клеток с высоким разрешением, сохраняя их жизнеспособность, нативные размеры и форму [20].

Статистическая обработка материала заключалась в расчете интенсивных и экстенсивных показателей средних величин, определении достоверности различия относительных и средних величин между каждой отдельно взятой изучаемой и контрольной группами с использованием t-критерия Стьюдента. Поправка на множественную проверку гипотез не проводилась, так как отсутствовали необходимость построения семейства статистических выводов и сравнения между представленными группами.

Результаты и обсуждение

При изучении пуповины основное внимание нами было уделено кровеносной системе. В 1—6-й группах наблюдалось преимущественно краевое стояние эритроцитов у эндотелия. В 2—4-й и 6-й группах в просвете сосудов чаще, чем в других группах, определялись стаз, агглютинация и гемолиз эритроцитов. Внутри сосудов был выявлен фибрин (в большей степени при СД 1-го типа), который располагался в виде как отдельных нитей, так и пластов. Кроме того, было зафиксировано преимущественно в венозном отделе наличие тромбов, и данный вариант нарушения кровообращения особенно был характерен для ДТЗ, преэклампсии и СД 1-го типа. Помимо этого выявлен диапедез эритроцитов через сосудистую стенку, что было в большей степени характерно для групп с гипотиреозом, ГСД, СД 1-го типа и ДТЗ.

Эндотелиальные клетки артерий пуповины плотно соединены между собой при помощи сложных стыков (рис. 1 на цв. вклейке). Они посредством тонких отростков, пронизывающих базальную мембрану, соединялись с подлежащими лейомиоцитами, формируя единую эндотелиомускулярную систему. Эндотелиальные клетки артерий и вен имели больший разброс в размерах при ДТЗ и СД 1-го типа — от 0,2 до 0,8 мкм. В этих же группах чаще, чем в других, наблюдалось нарушение строения стыков между ними. Кроме того, выявлены некротизированные фрагменты эндотелия, а также нарушение микрорельефа эндотелия. Складки на его поверхности увеличивались в размере и за счет этого близко располагались друг от друга. Здесь же наблюдались выросты плазмолеммы клеток (см. рис. 1а на цв. вклейке).

Рис. 1. Фрагменты пуповины при узловом зобе (а) и фрагменты плаценты при смешанном зобе у матери в эутиреоидном состоянии (б), при ДТЗ (в), при преэклампсии средней степени тяжести (г).

Клетки эндотелия сосуда пуповины рыхло соединены между собой. Альтернативные изменения отдельных клеток (а); преобладание промежуточных ворсин (б), просвет сосуда сужен за счет склероза (в, г); атомно-силовая микроскопия. а, б, в — трехмерное изображение, г — двухмерное.

В ворсинчатом хорионе наблюдались следующие изменения: в стволовых ворсинах стенки крупных сосудов нередко были утолщены и склерозированы, а просвет сужен (в части сосудов выявлены стаз и агглютинация эритроцитов), что также наиболее характерно для 3, 4 и 6-й групп. Тромбы в просвете сосудов наблюдались в 11% случаев при ГСД, в 13% — при эутиреоидном состоянии, в 16% — при гипотиреозе, в 17% — при СД 1-го типа, в 18% — при ДТЗ, и в 20% — при преэклампсии без эндокринопатии или на ее фоне (выше при СД 1-го типа).

При изучении стволовых и терминальных ворсин было выявлено изменение рельефа внутри сосудов ворсин, их площади и глубины (табл. 1).

Таблица 1. Показатели рельефа внутри сосудов ворсин, их площадь и глубина у женщин с различными видами акушерской патологии и эндокринопатий, мкм

Примечание. Здесь и в табл. 2 * — различие показателей по сравнению с таковыми в группе сравнения достоверно (p<0,05).

Стволовые ворсины имели максимальный перепад рельефа внутри сосудов ворсин плаценты при СД 1-го типа, ДТЗ и гипотериозе, при преэклампсии, ГСД и эутиреозе перепад рельефа статистически значимо не отличался от такового в группе сравнения. В терминальных ворсинах перепад рельефа значительно отличался лишь в группах патологий ЩЖ. Площадь сосудов как стволовых, так и терминальных ворсин достоверно уменьшалась при ДТЗ, гипотиреозе и СД 1-го типа. При оценке глубины капилляров показатели, в первую очередь, отображали их извилистость. Глубина расположения сосудов значительно уменьшалась в группах ДТЗ, гипотериоза и СД 1-го типа в терминальных, что свидетельствует о значительной извилистости изучаемых структур. Эндотелиоциты в части фрагментов ткани были атрофированы. В отдельных участках край был полностью сглажен. Четко проявлялись цитоплазматические мостики, связывающие эритроциты и эндотелий. По всей поверхности последнего были выявлены мелкие пористые углубления. В отдельных участках эндотелия определялись фокусы некроза. Именно здесь чаще всего формировались тромбы. По периферии стволовых ворсин выявлены участки со скоплением мелких, в большинстве своем полнокровных сосудов, что носило компенсаторный характер.

Особое внимание нами было уделено изучению строения эритроцитов как внутри сосудов ворсинчатого хориона (ворсинчатого дерева), так и находившихся в межворсинчатом пространстве (МВП). Было показано, что содержание нормальных эритроцитов (нормоцитов) снижалось до 76±1,5% при эутиреозе, до 67±1,9% — при гипотиреозе и до 65±1,3% — при ДТЗ, 70±4,5% — при ГСД, 60±3,8% — при СД 1-го типа, 63±3,3% — при преэклампсии. Содержание нормальных эритроцитов в сосудах ворсинчатого хориона у беременных группы сравнения составляло 85±1,6% (p<0,05).

При сочетании эндокринопатии у матери (особенно при СД 1-го типа и ДТЗ) с преэклампсией число нормальных эритроцитов не превышало 53±2,3%. Среди эритроцитов превалировали микроциты (клетки диаметром менее 7,0 мкм) диаметром 5,5±0,5 нм, толщиной 1,95±0,4 нм. Содержание эхиноцитов (предгемолитические формы эритроцитов) было невелико. Эритроцитов в ворсинах было несколько меньше, чем в МВП. Часто они имели форму неправильного овала. Наблюдались клетки вытянутой формы, что может свидетельствовать как о нарушении эластичности мембран, так и о затруднении прохождения через микроциркуляторное русло в связи с изменением его строения. Отдельные клетки крови были соединены между собой, а также с эндотелиоцитами цитоплазматическими мостиками и нитями фибрина (в наибольшей степени при СД 1-го типа и преэклампсии), что способствовало стазу, агглютинации эритроцитов и тромбозу. Данные нарушения в виде гемолиза эритроцитов наиболее хорошо были выражены при осложнении течения беременности преэклампсией.

При эндокринной и акушерской патологии появлялись такие виды дегенеративных клеток, как акантоциты, клетки в виде «спущенного мяча», что особенно хорошо видно при использовании зондовой микроскопии при нарушении цвета клеток, связанного с изменением их диаметра; появлялись так называемые пузырчатые клетки и даже шистоциты, представляющие собой осколки разрушенных клеток. Все эти виды измененных эритроцитов не подлежат восстановлению. Они относятся к группе необратимо деформированных или предгемолитических. Возрастало количество клеток с гемолизом. Но особенно четко эти патологические формы клеток просматривались при осложнении беременности, особенно при преэклампсии. Поверхность клеток была неровной. Происходило нарушение строения плазматических мембран клеток. Изменялась архитектоника плазматических отростков на поверхности эритроцитов, что особенно было заметно при ДТЗ и СД 1-го типа. Глубина впадины дискоцитов, подсчитанная с помощью изучения профиля клетки, имела следующие размеры: эутиреоз — 0,29±0,04 мкм, гипотиреоз — 0,30±0,03 мкм, ДТЗ — 0,25±0,04 мкм, СД 1-го типа — 0,28±0,05 мкм, ГСД — 0,20±0,02 мкм, преэклампсия умеренная — 0,15±0,02 мкм, преэклампсия тяжелая — 0,10±0,01 мкм, (группа сравнения — 0,38±0,05 мкм).

В сосудах миометрия при патологии ЩЖ у беременной нами обнаружены следующие особенности. Так, у пациенток с эутиреозом конфигурация сосудов практически не отличалась от таковой в группе сравнения, но при гипотиреозе, ДТЗ, СД 1-го типа и преэклампсии было обнаружено изменение их формы (рис. 2 на цв. вклейке). Эндотелиоциты во всех группах при патологии ЩЖ у беременной были более плоскими и тонкими, чем у пациенток группы сравнения, что происходило преимущественно за счет увеличения площади кровеносных сосудов. Складчатость эндотелиоцитов в большей степени была изменена в группах с гипотиреозом, ДТЗ, СД 1-го типа и преэклампсией. В полости сосудов обнаружены те же, что и в плаценте, варианты нарушения кровообращения. Форма и строение эритроцитов также в значительной мере были изменены. Помимо этого констатирован их диапедез. Выявленные преимущественно в венозном отделе тромбы, а также фибрин в виде отдельных нитей и пластов в большей степени были характерны для СД 1-го типа, ДТЗ и преэклампсии. Эритроциты чаще были в виде сферы. Следует отметить их выраженный стаз, агглютинацию и тромбоз. В случаях, осложненных преэклампсией, полнокровие было наиболее выражено.

Рис. 2. Фрагмент миометрия пациентки с ДТЗ. Образование тромба в спиральной артерии матки.

а — тромб, закупоривающий 70% сосуда; в, г — варианты. Атомно-силовая микроскопия: в — трехмерное изображение; а, г — двухмерное; б — графическое.

При изучении эритроцитов было показано, что содержание нормоцитов в группе сравнения было в пределах 84,30±1,41% от общего числа дискоцитов. При всех видах эндокринной и акушерской патологии их количество значительно уменьшалось и достоверно возрастало количество обратимо измененных, предгемолитических и дегенеративных форм (рис. 3, 4 на цв. вклейке). Менялось также и соотношение эритроцитов разных размеров. Наиболее выраженные достоверные изменения размеров эритроцитов выявлены (табл. 2) при СД 1-го типа (18,10±1,50% микроцитов и 14,20±2,14% макроцитов) и ДТЗ (19,20±1,50 и 15,10±2,51% соответственно), причем при данных эндокринных заболеваниях наблюдалось наибольшее увеличение количества макроцитов по сравнению с таковым в контрольной группе (группе сравнения). Заметный рост процентного содержания макроцитов по сравнению с этим показателем у практически здоровых беременных (группа сравнения) наблюдался также при тяжелой преэклампсии (табл. 2).

Рис. 3. Эритроциты у беременных с тяжелой формой преэклампсии (а, б).

Агглютинация эритроцитов. Кривизна и глубина центрального углубления изменена. Атомно-силовая микроскопия: а — трехмерное изображение, б — графическое изображение.

Рис. 4. Эритроциты у условно здоровой беременной (а, б) и у беременной с тяжелой формой преэклампсии (в, г).

б — фрагмент рис. 4, а: клетки с множественными выростами, поры на поверхности четко контурированы; г — фрагмент рис. 4, в: дискоциты в форме неправильного овала, кривизна и глубина центрального углубления изменены, строение пор на поверхности эритроцитов нарушено. Атомно-силовая микроскопия: а, в — трехмерное изображение.

Таблица 2. Соотношение размеров эритроцитов в сосудах миометрия при различных видах акушерской и эндокринной патологии, %

Поверхность клеток в сосудах миометрия во всех группах с патологией чаще была неравномерной, за исключением клеток с гемолизом. Происходило нарушение строения плазматических мембран клеток. Изменялась архитектоника плазматических отростков на поверхности эритроцитов, что было особенно заметно при ДТЗ и СД 1-го типа. При изучении поверхности эритроцитов было показано, что глубина впадины дискоцитов достоверно не отличалась от таковой в сосудах матки. На поверхности клеток при эндокринной и акушерской патологии регулярно обнаруживались округлые выступы шириной 0,28±0,08 мкм. Их организация была однотипной как в углублении, так и на вершине тора. Здесь же формировались более крупные выступы. В центральных участках отмечены также гребни, расположенные параллельно. На поверхности клеток наблюдались поры, образующие четкий однотипный рисунок размером 0,61±0,15 мкм с рельефными выступами внутри, который значительно менялся при различных видах акушерской патологии (см. рис. 4 на цв. вклейке).

Заключение

В ходе изучения сосудов пуповины плаценты и миометрия выявлены различные нарушения системы кровообращения: краевое стояние эритроцитов, стаз, агглютинация, гемолиз эритроцитов, а также изменения микроструктуры сосудов — нарушение соединений между эндотелиоцитами, нарушения микрорельефа клеток эндотелия. Кроме того, при исследовании ворсинчатого хориона и миометрия были выявлены утолщение и склерозирование стенок сосудов со значительным сужением их просвета, тромбы в просвете сосудов. При изучении стволовых и терминальных ворсин было показано изменение рельефа внутри сосудов ворсин, их площади и глубины.

При изучении эритроцитов внутри сосудов ворсин хориона и межворсинчатых пространств во всех обследуемых группах выявлено снижение количества нормальных эритроцитов и увеличение их деформированных и предгемолитических форм. В эритроцитах миометрия наблюдались схожие изменения при всех видах эндокринной и акушерской патологии со значительным уменьшением количества нормоцитов по сравнению с этими показателями в группе сравнения.

Таким образом, данные, выявленные при исследовании тканей плаценты и миометрия у женщин с патологией ЩЖ, СД 1-го типа, ГСД и преэклампсией с помощью атомно-силовой микроскопии, свидетельствуют о множественных изменениях на микроскопическом уровне, являющихся наиболее вероятной причиной осложнений беременности, и прежде всего гипоксии плода. Для установления клинической значимости выявленных структурных изменений в системе мать—плацента—плод необходимы дальнейшие научные исследования.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Павлова Т.В., Петрухин В.А.

Сбор и обработка материала — Каплин А.Н., Малютина Е.С., Селиванова А.В., Землянская Л.О.

Статистическая обработка — Каплин А.Н.

Написание текста — Павлова Т.В., Каплин А.Н., Малютина Е.С.

Редактирование — Павлова Т.В., Петрухин В.А.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.