Одним из аспектов применения современных постгеномных технологий является клиническая протеомика, основной раздел которой — выявление белков отличия (дифференциально-экспрессирующихся белков) в норме и при патологии. Идентификация этих белков и определение их посттрансляционных изменений1 расширяют возможности молекулярной диагностики [1—3]. Чрезвычайно важны такие исследования в области акушерства, пери- и неонатологии, где они наряду с практическим значением позволяют выяснить ранее неизвестные механизмы развития осложнений беременности. Среди лидирующих акушерских причин, приводящих к пре- и перинатальной патологии, особое место занимает плацентарная недостаточность (ПН; МКБ-10: O36.5), представляющая собой срыв адаптационно-гомеостатических реакций плаценты, ее неспособность поддерживать адекватный обмен между организмом матери и плодом [4, 5]. При срыве гомеостатических механизмов в протеоме2 наступают нарушения, которые проявляются в изменении состава, структуры и свойств белков, выполняющих многочисленные регуляторные функции.
Информативным объектом протеомных исследований при беременности являются околоплодные воды, белки которых имеют как материнское, так и фетоплацентарное происхождение. Это позволяет наиболее полно оценить дисбаланс в системе мать—плацента—плод, выявить белки—маркеры осложненного течения гестации и пренатальной патологии, а также дает возможность прогнозировать состояние новорожденного. Несмотря на несомненную важность исследования протеомного спектра околоплодных вод при физиологической и патологической беременности, немногочисленны и неоднозначны [6—8], а при ПН отсутствуют.
В связи с изложенным целью настоящей работы явилось изучение протеомного профиля и посттрансляционных изменений белков околоплодных вод в разные сроки физиологической беременности и осложненной ПН для выявления белков—маркеров акушерской патологии.
Материал и методы
В исследование включены 42 женщины в возрасте 20—29 лет (24,6±0,4 года), составившие две группы. В 1-ю группу вошли 22 клинически здоровые женщины с неосложненным течением беременности и родами в срок (контрольная группа). Во 2-ю — 20 женщин, доношенная беременность у которых осложнилась компенсированной ПН, верифицированной после родов (основная группа). Все пациентки наблюдались и обследовались в консультативной поликлинике Ростовского НИИ акушерства и педиатрии. По возрасту, индексу массы тела, паритету беременностей и родов, экстрагенитальной и гинекологической патологии женщины обследуемых групп были сопоставимы. Диагноз П.Н. поставлен на основании комплексного клинико-лабораторного обследования, включающего оценку биофизического профиля плода, результатов кардиотокографии, определения интенсивности фето- и маточно-плацентарного кровотока, а также определения сывороточной активности специфических плацентарных изоферментов [9]. Диагноз П.Н. был верифицирован при гистологическом исследовании плацентарной ткани.
В исследование не были включены пациентки с декомпенсированными формами соматических заболеваний, многоплодной беременностью, признаками преэклампсии, аутоиммунной патологией. Все включенные в исследование пациентки дали информированное согласие на расширенный алгоритм обследования. Проведение исследования разрешено этическим комитетом НИИ акушерства и педиатрии. У пациенток обеих групп питание было полноценным и сбалансированным по основным ингредиентам. Масса тела у них до наступления беременности была нормальной. Во время беременности наблюдались адекватные прибавки массы тела.
Во II триместре беременности пациентки основной группы были госпитализированы в отделение патологии беременных, где им проводилась терапия плацентарной дисфункции на основании Федеральных стандартов и порядка оказания помощи в акушерстве и гинекологии (Приказ № 572н от 02.04.13).
Исследования проведены в околоплодных водах, взятых в сроке гестации 18—20 и 39—40 нед. В первом случае околоплодные воды получали путем трансабдоминального амниоцентеза для исключения хромосомных аномалий у плода. Во втором случае — при вскрытии плодного пузыря в первом периоде родов.
Фракционирование белков проводили методом двухмерного электрофореза в полиакриламидном геле. Идентификацию белков после вырезания пятен из геля и процедуры трипсинолиза осуществляли методом время-пролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF-MS) с использованием программы Mascot MS Search (Matrix Science, Великобритания) и баз данных NCBI и Swiss-Prot.
О степени амидированности (наличие амидных групп) белков судили по уровню аммиака, отщепившегося после 10-минутного и 2-часового гидролиза белков в однонормальном растворе H2SO4 с помощью реакции несслеризации [10]. Содержание белковых аминогрупп оценивали спектрофотометрически по интенсивности окраски конечного продукта реакции между аминокислотами, суспензией фосфорнокислой меди и диэтилдитиокарбаматом [11].
Статистическую обработку данных протеомных исследований осуществляли с использованием лицензионного пакета программ Statistica (версия 6.0. фирмы «StatSoft. Inc.») и Excel 2003. Достоверность различий между сравниваемыми группами для каждого белка определяли с помощью критерия χ2 и четырехпольных таблиц сопряженности при анализе качественных признаков. Статистическую обработку результатов изучения функциональных групп белков проводили по той же программе. Достоверность различий определяли по t-критерию Стьюдента. Результаты оценивали как статистически значимые при p<0,05.
Результаты и обсуждение
Гистологическое исследование плацентарной ткани у женщин основной группы выявило наличие участков кальциноза, фиброза, гиперваскуляризации ворсин, мелкие межворсинчатые кровоизлияния и лимфоцитарную инфильтрацию. В последах пациенток контрольной группы видимых изменений материнской и плодовой поверхностей не обнаружено, в ряде случаев отмечались небольшие участки фибриноидных масс, умеренная гиповаскуляризация, незначительная лимфоцитарная инфильтрация децидуальной ткани.
Проведенные исследования свидетельствуют об изменении спектра белков околоплодных вод при ПН (табл. 1).
Отсутствие белка-1, связывающего инсулиноподобный фактор роста (ИПФР), модулирующего биологическую активность этого фактора роста, очевидно, отражается на процессах роста и развития плода [12]. Нарушение синтеза и, как следствие, снижение секреции в околоплодные воды неферментативных антиоксидантов церулоплазмина, гаптоглобина и антиоксидантного фермента пероксиредоксина-2 может способствовать усилению окислительных процессов (вплоть до окислительного стресса) и развитию внутриутробной гипоксии, развивающейся при ПН [13].
Поскольку жизнедеятельность плода зависит от доставки материнского ретинола, отсутствие ретинол-связывающего белка-4, сопровождающееся ухудшением снабжения плода витамином А, нарушает его нормальное развитие [14]. Подобная направленность при ПН продукции эпидермального белка, связывающего жирные кислоты, очевидно, сопровождается снижением трансмембранных реакций, клеточной дифференцировки и пролиферации в фетоплацентарном комплексе в связи с участием данного белка в этих процессах при физиологической беременности [15]. Отсутствие ферритина и трансферрина в околоплодных водах при ПН свидетельствует о нарушении депонирования железа, играющего важную роль в механизмах биологического окисления и обеспечении организма энергией [16].
В околоплодных водах, полученных в III триместре осложненной беременности, количество отсутствующих белков увеличивается. Кроме вышеописанных белков, отличия II триместра в конце осложненной беременности по сравнению с нормальным протеомным спектром околоплодных вод не обнаружены транстиретин, кальгранулины, А и В. Такая динамика содержания кальгранулинов, по-видимому, связана с их участием в процессах регуляции сократительной активности миометрия посредством Ca2+-зависимых реакций [17]. Появление трансферритина в конце нормальной беременности может объясняться необходимостью обеспечения организма плода тиреоидными гормонами для его адаптации к внеутробному существованию.
Наряду с отсутствием в околоплодных водах при ПН ряда белков во II и III триместрах выявлено появление дополнительных белков, не обнаруженных при физиологической беременности. Изменение их количества, вероятно, играет важную роль в механизмах развития данной патологии. Так, экспрессия NKG2D лиганда-2, усиливающего секрецию эмбриотоксических цитокинов, способна привести к активации апоптоза [18].
Аналогичную роль, очевидно, играет появление цинк-α-2-гликопротеина, который опосредованно участвует в процессах апоптоза [19]. По-видимому, модификация и таких, регулируемых этим белком процессов, как пролиферация, клеточная дифференциация вносит определенный вклад в развитие осложненной беременности. Вряд ли остается без последствий и появление CDC37-подобного белка, контролирующего смену фаз клеточного цикла и интенсивность пролиферативных процессов [20].
Помимо указанных дополнительных белков, характерных для обоих триместров, в 18—20 нед беременности, осложненной ПН, идентифицирован еще один белок, который отсутствует в 39—40 нед при этой акушерской патологии: нейрокальцин дельта. Усиление продукции нейрокальцина дельта, участвующего в ингибировании нейронального апоптоза [21], можно рассматривать как компенсаторный процесс, предотвращающий переход апоптоза в апонекроз в структурах мозга плода. Это особенно важно во II триместре гестации, в течение которого продолжается интенсивное развитие головного мозга плода.
В табл. 1, кроме молекулярных масс и изоэлектрических точек, приведена совокупность генов, обеспечивающих экспрессию выявленных белков отличия, с помощью которой может быть составлена генетическая карта предрасположенности к развитию конкретного осложнения беременности.
Анализируя причины изменения спектра белков при ПН, можно полагать, что значительную роль среди них играют нарушение синтеза mРНК и протеосинтеза, изменение активности протеолитических ферментов, трансплацентарных процессов, характера секреции белков в околоплодные воды. Определенное значение, по-видимому, имеет и модификация посттрансляционных реакций, влияющих на структуру и свойства белковых молекул, что также будет отражаться на составе протеома.
Полученные нами данные свидетельствуют об изменении структуры белков околоплодных вод при ПН, в частности, наличия и порядка расположения в них активных функциональных групп. Среди последних важную роль играют амидные группы, во многом определяющие степень спирализации, растворимость, заряд белка. Общий уровень амидных групп при ПН уменьшается во II триместре на 23,3%, а в III — на 19,9% по сравнению с соответствующими величинами при физиологической беременности (табл. 2).
Наряду с изменением общего количества амидных групп меняется соотношение между легко- и трудногидролизируемыми (прочносвязанными) группами, поскольку содержание последних снижается в большей степени: в 18—20 нед — на 31,5%, в 39—40 нед — на 34,4%. Для легкогидролизируемых амидных групп снижение составляет 22,2 и 20%, соответственно во II и III триместрах. Это может быть следствием количественных нарушений в составе белков, а также поступлением в околоплодные воды качественно измененных белковых молекул, подвергшихся посттрансляционной модификации и имеющих плацентарное происхождение. Подобная модификация белков плаценты обнаружена нами при ПН [22].
Коэффициент отношения легкогидролизируемых амидных групп к трудногидролизируемым в белках околоплодных вод увеличивается во II и III триместрах на 20 и 25% соответственно. Отклонение в содержании амидов разной устойчивости при ПН свидетельствует о глубокой перестройке белковых молекул, отражающейся на их физико-химических свойствах. Она приводит к перераспределению водородных и электростатических взаимодействий в молекулах белков, в результате которого снижается уровень структурных барьеров, защищающих пептидные связи от протеолитической атаки [23].
Одновременно с отклонениями в степени амидированности белков околоплодных вод изменяется и количество в них аминогрупп, принимающих участие в стабилизации нативной структуры белковых молекул (см. табл. 2). При П.Н. содержание аминогрупп во II триместре снижается на 27,5%, а в III — на 26,7% относительно показателей при физиологической беременности. Уменьшение содержания аминогрупп, подобно амидным, также сопровождается изменением свойств белков, в частности, утратой устойчивости белков к действию факторов, нарушающих их структуру.
Таким образом, результаты настоящего исследования свидетельствуют о том, что при ПН происходят достоверные отклонения в протеомном спектре околоплодных вод и постсинтетические модификации белков, проявляющиеся в изменении их амидированности и аминированности и, следовательно, повреждающие вторичную структуру белковых молекул. Поскольку эти изменения происходят на геномном и постгеномном уровнях, они, очевидно, служат первичным звеном в цепи молекулярных повреждений в фетоплацентарном комплексе. Идентифицированные белки отличия, появляющиеся в околоплодных водах при осложненной беременности, могут использоваться в качестве информативных маркеров развития ПН.
Выводы
1. При П.Н. в околоплодных водах выявлены и идентифицированы белки отличия, отсутствующие в разные периоды физиологической беременности: цинк-α-2-гликопротеин; CDC37-подобный белок 1; NKG2D лиганд-2 (во II и III триместрах); нейрокальцин дельта.
2. В протеомном профиле околоплодных вод при ПН по сравнению с таковым при физиологической беременности во II и III триместрах не выявлены пероксиредоксин-2; белок-1, связывающий ИПФР; ретинол-связывающий белок-4; гаптоглобин; эпидермальный белок-5, связывающий жирные кислоты; церулоплазмин; ферритин; трасферрин. В III триместре беременности не выявлены транстиретин; белок S100-A8 (кальгранулин А); белок S100-A9 (кальгранулин В).
3. В условиях ПН меняется степень аминированности и амидированности белков в околоплодных водах: уменьшается общее количество аминных и амидных групп, а также увеличивается соотношение между легко- и трудногидролизируемыми амидными группами, свидетельствующее о модификации свойств белков.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
*e-mail: tnp.rniiap@yandex.ru;
ORCID: http://orcid.org/0000-0002-0400-0652
1Посттрансляционные изменения — модификация белка после синтеза полипептидной цепи на рибосоме.
2Протеом — совокупность белков, экспрессируемых геномом исследуемого биологического объекта.