Проблема невынашивания беременности продолжает оставаться актуальной и социально значимой в практике акушера-гинеколога. Самопроизвольные аборты составляют 15-20% от всех желанных беременностей. Среди различных форм невынашивания беременности особое место занимает несостоявшийся аборт (неразвивающаяся беременность) - гибель эмбриона в раннем сроке беременности с длительной задержкой в полости матки. В структуре репродуктивных потерь число случаев неразвивающейся беременности составляет 10-20%. Причины неразвивающейся беременности многочисленны и нередко комплексны [3]. Особую роль в этиологии невынашивания беременности играет хромосомный дисбаланс. Так, в 6-7 нед беременности 60-75% абортусов имеют аномальный кариотип, в 12-17 нед - 15-20%, и в 17-28 нед - только 2-7% [14].
Таким образом, если около 50% эмбрионов I триместра беременности погибают вследствие естественного отбора зачатий с аномальным кариотипом, то причина гибели других эмбрионов имеет мультифакториальную природу, т.е. является результатом аддитивного действия многих факторов, связанных как с зародышем, так и с матерью, а также комплекса неблагоприятных условий внешней среды. Среди факторов внешней среды к причинам самопроизвольного аборта относится ряд социальных (курение, стрессы, вредные профессиональные факторы) и медицинских факторов (эндокринные, инфекционные, иммунные). Однако, по данным ряда авторов, в 20-40% случаев невынашивания беременности причина остается невыясненной. В настоящее время особое внимание уделяется изучению молекулярных вариантов ряда генов, модулирующих риск широко распространенных мультифакториальных заболеваний, к которым относится и синдром невынашивания беременности.
Описано около 7 различных групп генов, ассоциированных с риском невынашивания беременности. К ним относятся следующие генные сети: гены II фазы детоксикации (GSTM1, GSTT1, GSTP1); гены плазменного гемостаза (FGB, PTM, FVL, XII); гены иммунной системы (DQA1, DQB2, DQB1, HLA-G, ILIB); гены метаболизма гормонов (PGR, ER); гены факторов роста хориона и плаценты (VEGF, IGF1, TNFA, TGFB); гены метаболизма фолиевой кислоты и витамина В12 (MTHFR, MTRR, MTR) [1]. Влияние полиморфизма перечисленных генов на систему мать-плацента-плод осуществляется как со стороны матери, так и со стороны плода. Особая роль в этиологии ранней эмбриональной гибели отводится нарушениям самого эмбриона: эпигенетической регуляции, не выявленным, редким мозаичным вариантам хромосомных аномалий, однородительской дисомии, повышенной частоте мутаций повторяющихся последовательностей [4-7, 9, 12, 13].
Цель данного исследования - изучение частоты и структуры хромосомной патологии среди абортированных эмбрионов у женщин с неразвивающейся беременностью и анэмбрионией.
Материал и методы
Абортивный материал для исследования был получен в гинекологическом отделении ФГБУ НИИ «Охраны материнства и младенчества» в Екатеринбурге с 2010 по 2011 г. С помощью стандартного цитогенетического анализа исследован материал 71 абортуса при неразвивающейся беременности. Среди них 63 образца получены у женщин с клиническим диагнозом неразвивающейся беременности, поставленным в ходе динамического ультразвукового обследования, и характеризовались наличием в полости плодного мешка внутриутробно погибшего эмбриона. Остальные 8 образцов абортного материала представляли собой случаи анэмбрионии, характеризовавшейся отсутствием эмбриональных структур в полости плодного мешка. Эмбриональные ткани получали из полости матки методом вакуум-аспирации. Гестационный возраст эмбрионов составил 4-11,5 нед (7,5±1,8 нед).
В 56 случаях беременность наступила естественным образом, в 15 случаях - в результате применения вспомогательных репродуктивных технологий. Женщины получили полную информацию о цели проводимого исследования и подписали информационное согласие на его проведение.
Фрагменты плодного мешка тщательно отмывали от крови и децидуальной ткани в среде RPMI-1634 комнатной температуры. Отобранные отдельные ворсины хориона обрабатывали по стандартному протоколу ускоренного «прямого» метода приготовления препаратов хромосом из ворсин хориона. Приготовленные препараты окрашивали стандартным дифференциальным методом G-окраски с применением 0,25% раствора трипсина и раствора красителя Гимза [1]. Кариотипирование проводили на микроскопе Leica DM4000B c программным обеспечением LeicaCW 4000 Karyo.
Результаты и обсуждение
Стандартный цитогенетический анализ был успешно проведен в 71 случае спонтанных абортусов. В результате цитогенетического исследования в 33 (46%) случаях был выявлен нормальный кариотип и в 38 (54%) случаях - аномальный кариотип абортуса (табл. 1).
Среди выявленных 38 случаев аномального кариотипа у эмбрионов были обнаружены все типы хромосомных нарушений, описанных ранее другими авторами при ранней эмбриональной гибели, за исключением тетраплоидии и маркерных хромосом [1, 4].
Наиболее распространенной аномалией кариотипа абортусов были трисомии - 27 (71%) случаев (см. табл. 1), структура которых представлена в табл. 2.
В 2 случаях обнаружен сложный вариант двойной трисомии, с участием дополнительной половой хромосомы (Х) и 21-й в первом случае, 7-й и 20-й хромосом - в другом случае (см. табл. 1). Частота отдельных трисомий согласуется с наблюдениями других авторов [2].
По данным литературы, случаи моносомии по аутосомам крайне редки [1], в нашем исследовании мы обнаружили 1 случай моносомии 8-й хромосомы в мозаичной форме (mos 45,ХX,-8[8]/46,ХХ[8]).
Хромосомный дисбаланс половых хромосом был обнаружен в 3 случаях (см. табл. 1). В одном случае имела место дисомия Х хромосомы в мужском кариотипе (mos 48,ХХY,+21[7]/46,ХY[10]), в другом - трисомия Х в женском кариотипе (mos 47,ХХХ[10]/45,Х[4]/46,ХХ[4]). Оба варианта выявлены в мозаичной форме. Полная моносомия Х хромосомы выявлена также в 1 случае.
Как следует из табл. 1, полиплоидия в проведенном исследовании была представлена только триплоидией у 6 (15,8%) абортусов, распространенность которой согласуется с данными по другим популяциям [6, 11]. Триплоидия является либо результатом нарушения созревания половых клеток (отсутствие редукции диплоидного набора), либо оплодотворения одной яйцеклетки двумя сперматозоидами [1, 15]. Один случай представлял собой химерный вариант кариотипа (chi 69,XXY[10]/46,XY[8]).
Определенный интерес представляет изучение структуры хромосомных аномалий у абортусов с наиболее тяжелой морфологической формой нарушений эмбриогенеза - анэмбрионией. По результатам собственных исследований, среди 8 случаев анэмбрионии нами были выявлены 3 случая анеуплоидного кариотипа с трисомией по 15, 16 и 19-й хромосоме (табл. 3).
Интересной особенностью полученных результатов является высокая частота мозаичных форм хромосомных нарушений, которые составили 34% (13 случаев) от числа аномальных кариотипов (см. табл. 1). По данным исследований других популяций [6], проведенных с использованием стандартного цитогенетического анализа, число случаев мозаицизма по всем хромосомам колеблется от 0 до 14%. Следует учитывать, что стандартный цитогенетический анализ не позволяет отличить истинную трисомию и моносомию от потери хромосомы при приготовлении препаратов, особенно при мозаицизме низкого уровня. Кроме того, количество метафазных пластин часто ограничено, что не позволяет объективно судить о доле аномального клона клеток. Более достоверные результаты о наличии мозаичного варианта кариотипа можно получить методами молекулярной цитогенетики, например, методом FISH (fluorescence in situ hy bridization), который позволяет многократно увеличить количество анализируемых метафаз. Исследователи из Томска FISH-методом обнаружили высокую частоту мозаичных форм кариотипа спонтанных абортусов (37%) [10]. В работе С.Г. Ворсановой [2] с применением метода FISH обнаружен мозаицизм у 50,3% абортусов с аномальным кариотипом. Поэтому мы склонны считать выявленный мозаицизм в экстраэмбриональных тканях абортусов истинным, характерным для этиологии неразвивающейся беременности. Для исключения ложноположительного мозаицизма, обусловленного погрешностями техники приготовления цитогенетических препаратов, мы постоянно совершенствуем мастерство и контролируем качество обработки биологического материала.
Мозаичные нарушения кариотипа являются результатом соматического мутагенеза в тканях самого зародыша на постзиготических этапах развития. Другими словами, хромосомные аномалии у плода могут возникать не только на этапе гаметогенеза у родителей погибшего плода, но и в процессе имплантации, морфогенеза и развития эмбриона с исходно нормальным кариотипом. В настоящее время одной из причин хромосомного мозаицизма на ранних этапах онтогенеза человека рассматриваются нарушения эпигенетической регуляции экспрессии генов, выполняющих различные функции в ходе клеточного цикла. Исследования некоторых авторов указывают на взаимосвязь цитогенетических нарушений с аномалиями эпигенетического репрограммирования [10].
Следует отметить, что частота хромосомных аномалий среди абортусов при неразвивающейся беременности, по данным ряда авторов, выше, чем при самопроизвольных абортах [6, 10]. Следовательно, можно предположить, что гибель эмбриона при несостоявшемся аборте, вероятно, чаще вызвана генетическими факторами. Это ставит новые вопросы об этиологии и механизмах внутриутробной задержки погибшего эмбриона при несостоявшемся аборте и причинах гибели плода с нормальной хромосомной конституцией, о роли генетических и эпигенетических факторов в индивидуальном развитии человека.
Выводы
1. Наиболее распространенным нарушением кариотипа у абортусов при неразвивающейся беременности была трисомия (71%).
2. Значительная часть аномальных кариотипов абортусов была представлена мозаичными вариантами (34%).
3. В большинстве мозаичных кариотипов имеет место невысокая частота анеуплоидных клеток, что свидетельствует о митотических ошибках на постзиготическом этапе развития эмбриона.