Женщины с отягощенным акушерско-гинекологическим анамнезом (ОАА) составляют группу риска развития таких гестационных осложнений, как угроза прерывания беременности, хроническая плацентарная недостаточность, эклампсия и т.д. Основу патогенеза невынашивания беременности и патологических состояний, связанных с пролонгированием беременности, по мнению некоторых авторов, составляет эмбриоплацентарная дисфункция, клинические проявления которой определяются генетическим кодом и характером экзо- и эндогенных влияний.

Факторы риска развития невынашивания беременности, хронической плацентарной недостаточности, преэклампсии достаточно схожи, поэтому отсутствует возможность достоверного прогнозирования развития данных состояний [4-6]. Исследование генетических причин ОАА было выполнено на генах-кандидатах, имеющих отношение к тромбофилии, метаболизму фолиевой кислоты, липидному обмену, окислительному стрессу, функционированию ренин-ангиотензиновой системы и т.д. Однако предложенные в настоящее время системы диагностики наследственной предрасположенности к ОАА не имеют достаточной прогностической значимости. Это объясняется нелинейностью и сложностью взаимоотношений генотип-фенотип. Большинство ассоциативных генетических исследований [3, 9, 10] не учитывает таких феноменов генетической архитектуры, как локусная гетерогенность, фенокопии, ген-средовые и межгенные взаимодействия.

Эпистатические^[*] (ген-генные) взаимодействия - распространенное явление в патологических состояниях (болезнях) человека. Отдельные генетические варианты вносят малый вклад в формирование патологического фенотипа и соответственно положительные результаты ассоциации отдельных полиморфизмов с заболеваниями, как правило, не реплицируются через независимые выборки. Принимая эту гипотезу, следует искать сочетания генетических вариантов и анализировать межгенные и ген-средовые взаимодействия, играющие роль в формировании патологического фенотипа.

В настоящее время разработаны различные статистические методы анализа межгенных и ген-средовых взаимодействий: логистическая регрессия, нейронные сети, метод снижения многомерной размерности, метод комбинаторного разбиения, метод рестрикционного разбиения и др. [3].

Цель исследования - анализ межгенных взаимодействий генов-кандидатов тромбофилии, нарушений обмена гомоцистеина и регуляторов артериального давления у женщин с отягощенным акушерско-гинекологическим анамнезом.

В исследовании проанализированы данные изучения полиморфных вариантов кандидатных генов предрасположенности к различным видам акушерской патологии у 325 женщин, обратившихся за медицинской помощью в НИИ охраны материнства и младенчества Екатеринбурга за период с 2009 по 2011 г.

В исследование были включены беременные и женщины, проходящие прегравидарную подготовку. Пациентки были разделены на две группы в зависимости от характера акушерского анамнеза. Основную группу составили 197 женщин с отягощенным акушерским анамнезом, а именно с эклампсией и невынашиванием беременности (самопроизвольные выкидыши, преждевременные роды, неразвивающиеся беременности) в анамнезе. Контрольная группа была представлена 128 женщинами с физиологическим течением беременностей и родов в анамнезе. Возраст беременных в обеих группах варьировал от 21 года до 43 лет. Средний возраст пациенток с ОАА составил 32,2±0,4 года, в контрольной группе - 39,4±0,9 года. По среднему возрасту группы были сопоставимы.

У пациенток основной и контрольной групп проводилось молекулярно-генетическое типирование полиморфных вариантов генов предрасположенности к невынашиванию беременности и эклампсии.

1. Гены ключевых ферментов обмена гомоцистеина: MTHFR 677 С>T, MTHFR 1298A>C, MTR 1256A>G и MTRR 66A>G.

2. Гены компонентов системы гемостаза: FGB-455G>A, F2 20210G>A, F5 1691G>A, F7 10976G>A, F13 163 (100)G>T (Val34Leu), ITGA2 807C>T, ITGB3 1565T>C, PAI-1-675 5G>4G.

3. Гены регуляции артериального давления (АД) крови: ADD1 1378G>T, AGT 704T>C, AGT 521C>T, AGTR1 1166A>C, AGTR2 1675G>A, CYP11B2-344C>T, GNB3 825C>T, NOS3-786T>C, NOS3 894G>T.

Из 325 обследованных пациенток 114 были комплексно обследованы на все три группы изучаемых генов; 77 женщин были типированы по двум группам генов (компонентов гемостаза, регуляции обмена гомоцистеина).

Образцы ДНК пациенток получали из буккального эпителия, используя коммерческие наборы реагентов и протоколы для выделения ДНК. Для оценки количества выделенной геномной ДНК использовали набор реагентов контроля взятия материала КВМ для метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). В исследование брали не менее 1,0 нг геномной ДНК на реакцию. Генотипирование образцов по аллельным вариантам исследуемых генов проводили методом аллель-специфичной ПЦР в режиме реального времени со снятием кривых плавления продуктов амплификации. Анализ результатов ПЦР проводили в автоматическом режиме программного обеспечения детектирующего амплификатора ДТ-96.

Статистический анализ данных проводился с помощью пакета статистических программ Statistica 7.0 и SPSS 13.0. Различия между параметрическими переменными с нормальным распределением устанавливались при помощи t-критерия Стьюдента. Сравнение частот генотипов полиморфных вариантов отдельных генов между анализируемыми группами проводилось при помощи χ² Пирсона и χ² Йетса для числа наблюдений менее 10. Для оценки сочетаний генотипов различных генов использовали регрессионную модель пропорционального риска Кокса с оценкой значимости тестируемых переменных с помощью асимптотического критерия χ² Вальда. Нулевая гипотеза отвергалась при р<0,05. Тест на соответствие распределения генотипов закону Харди-Вайнберга в обеих выборках проводили с помощью критерия χ² с использованием программы Hardy-Weinberg equilibrium.

По результатам однофакторного анализа, включавшего 21 вариант однонуклеотидных замен в генах компонентов системы гемостаза, обмена гомоцистеина и регуляции АД, сравниваемые группы женщин с ОАА и с нормальным акушерско-гинекологическим анамнезом достоверно не различались по распространенности альтернативных аллелей и генотипов. Наблюдалась тенденция более высокой распространенности среди женщин с ОАА генотипа GG полиморфизма F13 Val34Leu G>T (χ² =10,78; р=0,06).

Полученные результаты подтверждают известный факт слабого влияния отдельных однонуклеотидных замен (SNPs) на развитие заболевания без их связи с остальной частью генома и без учета влияния внешней среды [2, 3, 7, 10]. Для основной массы изученных генов-маркеров относительный риск (RR, relative risk) развития заболевания не превышает 1,5. Следовательно, реальный вклад отдельно взятого полиморфизма в развитие мультифакториальной патологии сравнительно невелик [1]. Другими словами, чтобы выявить ассоциацию генетического фактора (SNP) с определенным заболеванием, необходимо рассматривать совокупность множества генов, вовлеченных в сложные механизмы патогенеза, и факторы внешней и внутренней среды организма [3, 10].

По этой причине для дальнейшего поиска влияния ассоциаций изучаемых полиморфизмов генов на развитие акушерской патологии мы применили специальный метод статистического анализа (логистическая регрессия), который позволяет учитывать в группах пациенток статистические взаимодействия распределения мутаций множества генов [3].

Для учета возможного влияния различных комбинаций изучаемых генов на риск возникновения акушерско-гинекологических осложнений была использована логистическая регрессионная модель пропорционального риска Кокса. В пошаговый логистический регрессионный анализ были включены три группы полиморфных вариантов генов: обмена гомоцистеина (MTHFR 677С>T, MTHFR 1298A>C, MTR 1256A>G и MTRR 66A>G); компонентов системы гемостаза (FGB-455G>A, F220210G>A, F5 1691G>A, F7 10976G>A, F13 163(100)G>T (Val34Leu), ITGA2 807C>T, ITGB3 1565T>C, PAI-1-675 5G>4G); регуляции АД (ADD11378G>T, AGT 704T>C, AGT 521C>T, AGTR11166A>C, AGTR2 1675G>A, CYP11B2-344C>T, GNB3 825C>T, NOS3-786T>C, NOS3 894G>T). Анализ включал результаты генотипирования 114 пациенток, среди которых у 69 наблюдался отягощенный акушерский анамнез, а у 45 - нормальный акушерский анамнез. По данным многофакторного анализа, была сформирована модель, представляющая собой совокупность из четырех генотипов, три из которых относятся к генам системы регуляции АД (AGT 704CC, GNB 825CT, NOS3 894GT) и один из системы метаболизма гомоцистеина (MTR 2756AG). В таблице

ОАА_{прогноз} = В+e^b·x1+ e^b·x2 + e^b·x3 + e^b·x4.

Пользуясь подобными моделями, можно использовать широкий спектр генетических вариантов генов (SNPs) и средовых факторов для прогнозирования индивидуальной предрасположенности к акушерско-гинекологической патологии на любом этапе консультирования женщины. Для этого необходимо провести на локальной популяции исследование на достаточно большой выборке пациентов для получения статистически достоверных данных, чтобы экстраполировать результаты моделирования на генеральную выборку. Необходимо учитывать, что обнаруженные статистически значимые ассоциации могут быть недостоверными при изучении других популяций [1].

Комплексная оценка различных групп полиморфизмов, влияющих на различные пути патогенеза определенной мультифакториальной патологии, является более перспективной, чем однофакторный анализ [10]. Мультифакторный анализ позволяет учесть генетическую архитектуру сложных отношений генотип-фенотип. Реализация генотипа отдельных генов зависит от локусной гетерогенности, наличия фенокопий, межгенных влияний, ген-средовых взаимодействий [3, 8, 9].

В проведенном исследовании на фоне отсутствия достоверных различий между группами по отдельным полиморфизмам статистически значимым предиктором (прогностическим факторам) акушерских осложнений явилось определенное сочетание генотипов (AGT 704CC, GNB 825CT, NOS3 894GT, MTR 2756AG). Данную ситуацию можно рассматривать как статистический эпистаз, который определяется как отклонение от аддитивности в математической модели, обобщающей отношения между мультилокусными генотипами и фенотипической изменчивостью в популяции, которые не могут быть предсказаны только на основе рассмотрения действия генов раздельно [3, 9].

1. Комплексная оценка различных групп полиморфизмов, влияющих на различные пути патогенеза определенной мультифакториальной патологии, является более перспективной, чем однофакторный анализ.

2. Статистические методы моделирования позволяют более эффективно выявлять ассоциации множества предикторов с определенным патологическим процессом.

3. В проведенном исследовании 21 полиморфизма генов обмена гомоцистеина, компонентов гемостаза и регуляции АД на фоне отсутствия достоверных различий между группами по отдельным полиморфизмам статистически значимым предиктором акушерских осложнений явилось определенное сочетание генотипов (AGT 704CC, GNB 825CT, NOS3 894GT, MTR 2756AG).