Большой интерес к изучению генитальной папилломавирусной инфекции (ПВИ) обусловлен широкой циркуляцией вирусов папилломы человека (ВПЧ) до 40-80% - среди населения репродуктивного возраста [2]. Более 30 типов ВПЧ способны вызывать поражения аногенитальной области - от остроконечных кондилом до плоскоклеточного рака шейки матки [11, 12]. В связи с этим вопрос ранней диагностики инфицирования ВПЧ остается актуальным и в настоящее время. С появлением полимеразной цепной реакции (ПЦР) возникла возможность не только выявлять ДНК ВПЧ, но и определять его генотипы. Одним из наиболее удобных в настоящее время методов, позволяющих обнаружить вирус, а также дать однозначный ответ на вопрос, каким генотипом ВПЧ произошло заражение, сколько генотипов присутствует одновременно, какова вирусная нагрузка, является метод ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) [8]. Для эпидемиологического и клинического мониторинга выявленных случаев ПВИ важно проводить типирование онкогенных папилломавирусов. Скрининговые тест-системы для выявления ДНК ВПЧ определяют принадлежность папилломавирусов к той или иной группе онкогенного риска без уточнения типа вируса внутри группы. Степень риска развития рака напрямую зависит от принадлежности ВПЧ к тому или иному типу из группы высокого канцерогенного риска (ВКР), а также от инфицирования несколькими типами ВПЧ одновременно [4, 9]. Наиболее онкогенными являются ВПЧ-16, 18, 31, 33 и 45-го типов, среди которых ВПЧ-16 обнаруживается в 70% случаев рака, ВПЧ-18 - в 10%, выявление ВПЧ-31 и ВПЧ-45 при раке достигает 4%, ВПЧ-33 типа - 2% случаев. Таким образом, инфицирование ВПЧ-16 и ВПЧ-18 значительно чаще приводит к развитию рака шейки матки (РШМ) [1, 13]. Типирование ВПЧ позволяет также выявить персистенцию онкогенных папилломавирусов, на которую указывает неоднократное повторное обнаружение одного и того же генотипа вируса [5]. Длительная персистенция ВПЧ-16 и ВПЧ-18 является маркером повышенного риска развития РШМ [3, 10]. Еще одной важной особенностью ВПЧ-тестирования, способствующей повышению специфичности исследования, являются возможность определения количества вируса и введения порога клинической значимости вирусной нагрузки. Показано, что выявление вируса в количестве, не превышающем пороговый уровень, имеет малое клиническое значение, так как свидетельствует о высокой вероятности самостоятельного излечения без применения медикаментозных и хирургических средств [7]. Основаниями для введения порога клинической значимости послужил ряд работ, указывающих на то, что вирусная нагрузка ниже определенного значения («порог значимости») не встречается в образцах тяжелой дисплазии и рака и ассоциирована с регрессией инфекции («клинически незначимое инфицирование»). Нагрузка выше данного порога обозначается как «клинически значимое инфицирование». Кроме того, выделяется второй порог - «порог прогрессии». Вирусная нагрузка выше данного значения обозначается как повышенная и ассоциирована с большей вероятностью наличия цервикальной интраэпителиальной неоплазии (ЦИН) II-III степени или ее развития. На основании проведенных в ЦНИИ эпидемиологии исследований и данных мировой литературы были определены пороговые значения концентрации ВПЧ в образце: 3 логарифма (или 10³) геномов ВПЧ на 100 тыс. клеток человека - «порог клинической значимости», 5 логарифмов (10⁵) геномов ВПЧ на 100 тыс. клеток - «порог прогрессии». В ходе признания правильности пороговых значений концентрации ВПЧ (валидации) показано, что введение «порога клинической значимости» позволяет более чем на 20% повысить диагностическую специфичность исследования при сохранении диагностической чувствительности [6].

Цель и задачи исследования: используя метод ПЦР-РВ оценить распространенность, кратность инфицирования различными генотипами ВПЧ ВКР, вирусную нагрузку среди вируспозитивных женщин.

Всего были обследованы 738 женщин в возрасте от 17 до 60 лет, обратившихся в клиники Нижнего Новгорода по поводу заболеваний шейки матки различного генеза и генитальных инфекций. Материалом для исследования служили образцы эпителия шейки матки, собранные с помощью одноразовых цервикальных цитощеток и помещенные в жидкую консервирующую среду. Для выявления и определения генотипа ВПЧ использовали тест-систему Ампли Сенс ВПЧ ВКР генотип-Fl, Ампли Сенс ВПЧ ВКР скринтитр-Fl. Наборы данных реагентов предназначены для выявления, дифференциации и количественного определения ДНК ВПЧ ВКР 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58 и 59-го типов в клиническом материале методом ПЦР с гибридизационно-флюоресцентной детекцией. Принцип метода основан на одновременной амплификации* (мультикомплекс - ПЦР) в одной пробирке участков ДНК трех типов ВПЧ и участка ДНК β-глобинового гена, используемого в качестве эндогенного внутреннего контроля. ПЦР-анализ на наличие ДНК двенадцати типов ВПЧ проводится в четырех пробирках. Каждый тип регистрируется по своему каналу флюоресценции, что позволяет не только выявлять, но и определять генотип обнаруженного ВПЧ ВКР. Концентрацию ДНК ВПЧ в исследуемых пробах определяли с помощью стандартных кривых, построенных с использованием ВПЧ клонов данных типов. Вирусную нагрузку рассчитывали как количество копий ДНК ВПЧ, выраженное в lg на 105 клеток. Полученный материал исследовали методом ПЦР-РВ с использованием анализатора iQ5 Cycler и комплекта тест-систем.

Результаты обследования женщин позволили выявить высокую инфицированность онкогенными папилломавирусами - 546 (74%) пациенток. Для определения зависимости между частотой выделения ВПЧ и возрастом женщины обследуемую группу разделили по возрастным категориям. Наиболее многочисленная группа (437) - женщины от 20 до 30 лет, среди них положительные результаты были установлены у 346 (79,2%). В группе от 31 года до 40 лет (n=138) положительные находки составили 90 (65,2%) женщин. Пациентки моложе 20 лет в настоящем исследовании составили 12 человек, среди них ВПЧ ВКР выявлены у 11 (91,7%). В возрасте старше 40 лет число обследованных женщин было значительно меньше, чем в репродуктивный период (46), однако процент выявлений был высоким - 76,1 (35). Это связано, скорее всего, с продолжающейся сексуальной активностью в эти годы. В возрасте 50-60 лет выявляемость ВПЧ ВКР составляла 40% (4 женщины), снижаясь в 2 раза относительно возрастной группы 20-30 лет. Необходимо отметить, что у пациенток в возрасте до 40 лет отмечалось высокое число выявления ВПЧ ВКР - 78,7%. Эти цифры объясняются эпидемиологическими характеристиками и патогенетическими особенностями ПВИ. У 95 (12,8%) пациенток не был указан возраст; в этой группе ВПЧ ВКР были выявлены у 60 (63,2%) женщин.

Анализ частоты выявления различных генотипов ВПЧ показал, что 56-й и 16-й типы были обнаружены чаще других - в 33 и 15,4% случаев соответственно. Доминировали геноварианты 33-й (68 женщин, 7,1%), 51-й (67, 7,0%), 31-й (65, 6,8%), 39-й (59, 6,1%), 45-й (58, 6,0%). Число случаев остальных генотипов варьировало от 2 до 5%. Кратность инфицирования отдельными типами ВПЧ ВКР показала, что в материале у 54,8% (299) обследованных пациенток присутствовал только один генотип ВПЧ ВКР, у 26,2% (143) было выявлено два генотипа. Три генотипа ВПЧ и более обнаружены при обследовании 104 (19%) женщин: 3 типа - у 62 (11,3%) пациенток, 4 типа - у 26 (4,8%), 5 типов - у 12 (2,2%), 6 типов - у 3 (0,5%), 7 типов - у 1 (0,2%).

При исследовании распределения вирусной нагрузки среди ВПЧ-позитивных лиц (n=715), показано, что число женщин - носительниц клинически значимой концентрации ВПЧ составляло 319 (44,6%), чаще всего встречалась концентрация 3-5 lg на 100 тыс. клеток - у 191 (26,7%) пациентки, далее следовала концентрация 2-3 lg - у 176 (24,6%) и концентрация 1-2 lg - у 74 (10,4%). Число пациенток, имевших клинически значимую концентрацию ВПЧ, было больше, чем таковых с клинически малозначимой концентрацией (319 и 271, или 45 и 38%). У отдельных женщин имелась клинически малозначимая концентрация ВПЧ, что может свидетельствовать о высокой вероятности самостоятельного излечения в этой группе без применения медикаментозных и хирургических средств. Большая группа - 128 (18%) женщин явились носительницей ВПЧ с вирусной нагрузкой, превышающей порог клинической значимости. Это группа, которая нуждается в дальнейшем обследовании и наблюдении.

1. Полученные данные подтверждают высокий уровень инфицированности ВПЧ у женщин с различными гинекологическими заболеваниями, что свидетельствует о необходимости проведения скрининговых исследований методом ПЦР для выявления ВПЧ высокого канцерогенного риска при профилактических осмотрах женщин.

2. Определение вирусной нагрузки является новым подходом в диагностике ПВИ, поэтому заслуживает особого внимания.

3. Генодиагностика ПВИ позволяет быстро с высокой чувствительностью и специфичностью выявлять этиологический фактор возможной патологии, определять группы риска онкозаболеваний урогенитального тракта у женщин.