Исследование состава микробиоты носоглотки детей с хроническим аденоидитом с использованием метода масс-спектрометрии по микробным маркерам

Последнее десятилетие ознаменовалось формированием новых представлений о развитии хронического процесса воспаления, в том числе и на слизистой оболочке носоглотки. Основные открытия в этой области связаны с изучением бактериальных биопленок. Накопившиеся данные свидетельствуют о новых свойствах бактерий, находящихся в составе сообществ, наиболее актуальным из которых для практической медицины является повышенная выживаемость микроорганизмов в биопленках [8, 11, 12, 13, 14, 16].

Целью работы явилось изучение видового и количественного состава микрофлоры слизистой оболочки носоглотки методом детектирования микроорганизмов по химическим маркерам в сравнении с бактериологическим исследованием у детей с диагнозом «хронический аденоидит».

Пациенты и методы. Работа основана на результатах обследования 68 пациентов, проходивших плановое хирургическое лечение в ЛОР-отделении ККБ г. Красноярска в 2010-2013 гг. Возраст пациентов колебался от 3 до 12 лет, средний возраст составил 5,3 ± 2,8 года. Среди детей мальчиков было 34 (50%), девочек - 34 (50%). Основным критерием включения в исследование явилось наличие у пациентов клинических проявлений хронического аденоидита с показаниями для хирургического лечения.

Аденотомию выполняли под эндотрахиальным наркозом. Перед удалением под контролем эндоскопа стерильным тампоном проводили сбор материала с поверхности глоточной миндалины, используя коммерческие транспортные среды со средой Эймса (производство БиоМерье, Франция). Посев проводили методом секторов на дифференциально-диагностические среды (кровяной агар, желточно-солевой агар, среда Эндо, энтерококкагар), учитывали количество колоний и выделяли чистые культуры микроорганизмов с их идентификацией. Одновременно отобранный на стерильные зонды биологический материал подвергали серии химических модификаций, в результате которых анализировали лишь метиловые эфиры жирных кислот, спирты и альдегиды, проводя идентификацию микроорганизмов по специфическим жирным кислотам методом газовой хроматографии и масс-спектрометрии [4-7, 15].

Для клинической диагностики микроорганизмов в составе биопленки используются различные молекулярные методы, в том числе газовая хроматография и ее сочетание с масс-спектрометрией. Детектирование микроорганизмов в составе биопленки проводится по составу специфичных жирных кислот, альдегидов, спиртов и стеринов, определяемых в мазке, взятом с поверхности удаленной глоточной миндалины. В основе метода лежит высокоточное определение специфических маркерных молекул, входящих в состав клеточных липидов [3].

Этот метод микробиологического исследования быстр и универсален, поскольку не требует выращивания отдельных микроорганизмов на специальных средах и проведения для каждого из них специальных биохимических тестов для определения вида возбудителя [2]. Точное количественное определение микроорганизмов способствует назначению целенаправленной антибактериальной терапии и оперативному контролю ее эффективности. Метод зарегистрирован Росздравнадзором в качестве новой медицинской технологии (Разрешение ФС №2010/038 от 24 февраля 2010 г.). Метод масс-спектрометрии позволяет получить информацию о «замаскированной» части микст-инфекции, состоящей из некультивируемых в условиях лабораторий клинической микробиологии микроорганизмов. По сравнению с традиционными методами бактериологического исследования использование хемодифференциации с помощью хромато-масс-спектрометрии позволяет значительно сократить время исследования до 2,5 ч и снизить его стоимость, минуя стадии повторных пересевов первичных колоний и тестовых ферментаций, которые особенно сложны и трудоемки для анаэробов.

Известно, что в процессе метаболизма микроб­ные клетки производят низшие карбоновые кислоты, набор которых является видоспецифическим [2, 3, 10]. Метод детектирования микроорганизмов по жирным кислотам-маркерам сходен с генетическим анализом (ПЦР, определение последовательности нуклеотидов 16sРНК). Однако высокочувствительный и селективный метод газовой хроматографии - масс спектрометрии позволяет одновременно измерять концентрации более сотни микробных маркеров непосредственно в анализируемом материале: крови, моче, биоптатах и других биологических жидкостях и тканях без использования тестовых биохимических материалов.

Отделяемое с поверхности глоточной миндалины в количестве 0,04 г подвергали кислому гидролизу в 0,4 мл 1 М HCl на метаноле в течение 1 ч при температуре 80 °С. В результате реакции метанолиза жирные кислоты, входящие в состав сложных липидов пробы, освобождались в виде метиловых эфиров, которых двукратно экстрагировали 200 мкл гексана, высушивали и обрабатывали 20 мкл N, О-бис(триметилсилил)-трифторацетамида в течение 15 мин при температуре 80 °С, для получения триметилсилильных эфиров гидроксикислот. Смесь эфиров в количестве 1 мкл вводили в инжектор хромато-масс-спектрометрической системы HP-5973 Hewlett-Packard (США). Для управления и обработки данных использовали штатные программы прибора. Хроматографическое разделение пробы осуществляли на капиллярной колонке 0,25 нм × 25 м с метилсиликоновой привитой фазой HP-5ms Hewlett-Packard. Площади пиков маркеров на масс-фрагментограммах интегрировали автоматически по заданной программе. Полученные данные были введены в программу расчета, подготовленную в электронных таблицах Excel.

Метод характеризуется следующими показателями: определение более 50 микроорганизмов одновременно в одном анализе при универсальности в отношении разных групп микроорганизмов - бактерий, грибов, вирусов. Время анализа составляет 2,5 ч, чувствительность - 10³ – 10⁴ клеток в пробе, селективность - до вида.

Измеренные концентрации микробных жирных кислот подставляют блоком в шаблон электронной таблицы EXCEL, в которой автоматически происходит реконструкция количественного состава микст-инфекции в виде стандартной таблицы результатов, где полученные данные сопоставлены с нормой в табличной и графической формах. На основании выработанного ранее статистического критерия [1,10], отклонения от нормы приобретают клиническую значимость, когда численность микроорганизмов изменяется вдвое по сравнению с нормой.

Результаты исследования. По результатам микробиологического исследования на поверхности глоточной миндалины были идентифицированы: S. Aureus (20% от общего отчета микробиоты), S. haemoliticus (18%), S. Epidermidis (15%). Также присутствовали в меньших количествах E. coli, E. faecium, P. aeruginosa, E. faecalis, P. morganii, P. mirabilis, S. saprophyticus, N. Subflava (рис. 1).

При этом в 30% роста флоры не выявлено, в 36% случаев получена монокультура и в 34%  - ассоциации микроорганизмов.

В то же время, данные хромато-масс-спектрометрического исследования выявили присутствие в очаге воспаления и других микроорганизмов (рис. 2), в том числе Clostridium ramosum, Fusobacterium/Haemophylus, Sp. Enterobacteriaceae (E. coli и др), Eubacterium moniliforme, Nocardia asteroides, Butyrivibrio/Cl. Fimetarum, Propionibacterium jensenii, Afipia sp., Helicobacter mustelae, Actinomycetes 10Me14, микроскопические грибов и вирусов (Herpes sp.).

Из полученных результатов следует, что наряду с культивируемой флорой метод масс-спектрометрии микробных маркеров позволяет выявить дополнительные изменения микроэкологического статуса слизистой оболочки носоглотки. Наши исследования показали, что у детей с хроническим аденоидитом определяется избыточная концентрация маркеров Enterobacteriaceae и Clostridium ramosum c периодическим подключением многочисленных представителей рода Eubacterium. Более чем втрое по сравнению с нормой растет концентрация маркеров Clostridium ramosum и Clostridium propionicum, почти у всех больных возрастает количество E. lentum.

Из данных результатов газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией следует, что измерение микробных маркеров in situ выявляет новую группу микроорганизмов из числа трудно культивируемых и поэтому мало известных в клинической практике. Эти участники инфекционного процесса - Clostridium, Eubacterium, Enterobacteriaceae, Lactobacillus, Helicobacter - обладают высокой патогенетической активностью, и вызванные ей заболевания трудно поддаются лечению [9,15].

Выводы.

Данные микробиологического исследования в сравнении с хромато-масс-спектрометрией показали, что определение 60-80% микробиоценоза слизистой оболочки носоглотки недоступно для культуральных методов исследования.

Данные хромато-масс-спектрометрии c поверх­ности удаленной глоточной миндалины показывают, что наряду со стрептококками и стафилоккоками определяются маркеры энтеробактерий, эубактерий, клостридий и различных видов грибов.

Несомненным достоинством метода хромато-масс-спектрометрии являются информативность, чувствительность, определение труднокультивируемых микроорганизмов, возможность расширять перечень определяемых химических маркеров.

Таким образом, использование в клинической практике результатов хромато-масс-спектрометрии может способствовать строго индивидуальному подбору оптимального метода лечения у больных хроническим аденоидитом.