Протеомный анализ сыворотки крови: роль в поиске биомаркеров атеросклероза

Атеросклероз является одной из основных причин сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) и их осложнений, поэтому усилия, направленные на раннее выявление лиц с повышенным риском развития указанных заболеваний, играют ведущую роль в их профилактике, диагностике, прогнозировании. Хорошо известно, что, применяя традиционные факторы риска ССЗ, несмотря на их высокую прогностическую ценность на популяционном уровне, нельзя полностью оценить индивидуальный риск возникновения и развития сердечно-сосудистой патологии [1]. С помощью уже известных биомаркеров можно получить важную информацию о функционировании того или иного метаболического пути, однако их определение не всегда связано с существенным повышением диагностической или прогностической ценности. У значительной части больных ССЗ нет ни одного или имеется только один из известных факторов сердечно-сосудистого риска [2], а оптимальный способ выявления лиц с промежуточным сердечно-сосудистым риском до сих пор не найден, что особенно подчеркивает необходимость поиска скрининговых биомаркеров [3].

Появление высокотехнологичных методов исследования произвело революцию в медико-биологических исследованиях. Многие наиболее перспективные технологии персонализированной медицины объединяются в рамках омиксных технологий: геномика, транскриптомика, протеомика, метаболомика, липидомика, цитомика (анализ совокупности белков в клетках, в том числе в клетках крови) и др.

Переход от изучения генома к транскриптому и протеому выявляет все бóльшую биологическую сложность понимания путей развития и прогрессирования атеросклероза. Процесс экспрессии генов, когда информация, содержащаяся в ДНК, транскрибируется в мРНК и транслируется в специфические белки, является лишь первым шагом в понимании более сложных биологических взаимодействий. Такие взаимодействия происходят как внутри белков и включают посттрансляционные модификации (протеолиз, фосфорилирование, ацетилирование, гликозилирование, нитрозилирование, метилирование), так и между белками (белок-белковые взаимодействия). В свою очередь, белки оказывают разнообразное влияние на структуру и функции клеток, тканей, органов и организмов, включая передачу сигналов, контроль метаболизма, регуляцию роста и старения. В отличие от генетических данных и соответствующих полигенных показателей риска (которые по своей сути статичны) данные о белках и соответствующие маркеры риска, формируемые на основе белков, динамичны и отражают широкий спектр воздействующих на организм стимулов окружающей среды и поведения, например изменение образа жизни, физическую активность, питание [4, 5].

Применение омикс-технологий можно считать этапом перехода к персонализированной медицине — комплексному научному направлению, в рамках которого изучается роль индивидуальных особенностей пациента с целью повышения эффективности и безопасности лечения, в том числе медикаментозного. Одним из доступных для биомедицины подходов к изучению широко распространенных хронических неинфекционных заболеваний (ХНИЗ), в том числе связанных с атеросклерозом, ССЗ, является анализ протеома, или протеомное профилирование, в частности сыворотки крови.

Цель обзора — анализ современной литературы, посвященной разработкам микрочиповой технологии протеомного анализа и достижениям в поиске белковых детерминант заболеваний, связанных с атеросклерозом.

Поиск публикаций проведен в базах данных MedLine, PubMed, Scopus, Cochrane Library и Google Scholar по ключевым словам (на русском и английском языках): протеом (proteome), протеомика (proteomics), микрочипы (microarrays). В обзоре литературы рассматривали только доступные полнотекстовые статьи; анализ публикаций проведен начиная с 2000 г., дата последнего поиска: 27 июля 2022 г.

В 2010 г. стартовал международный проект, организованный Human Proteome Organization (HUPO), названный «Протеом человека» (Human Proteome Project — HPP). Странами-инициаторами проекта являются США, Российская Федерация, Республика Корея, Швеция, Канада и Иран. Цель проекта — систематическое картирование всего набора белков человеческого организма с использованием доступных в настоящее время и вновь появляющихся методов, основанное на исследованиях, выполненных в лабораториях по всему миру. На официальной странице HUPO изложены основные направления исследований: протеом человека в целом, протеомика мозга, протеомика стволовых клеток, изучение антител, определение биомаркеров заболеваний и т.д. [6]. Российская часть проекта заключается в определении содержания белков, кодируемых генами хромосомы 18 человека, выбранной по оптимальному соотношению количества белок-кодирующих генов и их медицинской значимости [7].

В рамках проекта несколько исследовательских групп начали собирать приоритетные списки белков, относящихся к различным заболеваниям и биологическим системам, и сделали их общедоступными. Это списки приоритетных белков (наиболее значимых с точки зрения их вовлеченности в патогенез заболеваний), которые могут быть полезны для изучения биологических процессов, связанных с различными физиологическими системами (сердечно-сосудистой, церебральной, печеночной, почечной, дыхательной, пищеварительной), а также в рамках содействия усилиям по широкому внедрению технологий протеомики в биомедицинские исследования [8]. Именно в связи с этим один из разделов проекта «Протеом человека» посвящен биологии и болезням (Biology/Diseases-HPP). Ожидается, что завершение этого проекта позволит понять биологию человека на клеточном уровне и заложит основу для разработки диагностических, прогностических, терапевтических и профилактических медицинских приложений.

Значительная часть биомедицинских исследований, в том числе с применением омикс-технологий, посвящена изучению белков, характерных для болезней, и определению их роли в патогенезе заболеваний. Анализ эпигенома, транскриптома, протеома, метаболома и липидома сыворотки и клеток крови позволяет обнаруживать множество так называемых циркулирующих биомаркеров, т.е. тех биомолекул, которые функционируют в различных клеточных и внеклеточных компартментах, а попадая в кровь, служат отражением либо нормальных физиологических процессов, либо патологических изменений, ассоциирующихся с заболеванием. С развитием технологий протеомики стало возможным разрабатывать целевые протеомные анализы, которые позволяют точно определить количественный состав белков, а также их посттрансляционные модификации.

В последние годы возрастает интерес не только к изучению организмов на геномном уровне, но и к характеристике их протеома. Очевидно, что решение такой задачи было бы невозможно без наличия соответствующих технологий. На современном этапе наиболее подходящими методами анализа сложных белковых образцов наряду с двумерным (2D) гель-электрофорезом и масс-спектрометрией в различных вариантах являются так называемые микрочиповые (microarray) технологии [9].

История протеомного анализа началась в середине XX века, когда группа шведских ученых под руководством P. Edman разработала химический метод секвенирования пептидов (1950 г.) с последующим созданием автоматического белкового секвенатора (1967 г). Крупнейшим достижением стала расшифровка структуры первой белковой молекулы — инсулина (1953 г.), за что британский ученый F. Sanger удостоен Нобелевской премии по химии (1958 г.). Еще одна Нобелевская премия (по физиологии и медицине, 1977 г.) присуждена R.S. Yalow за развитие радиоиммунологических методов определения пептидных гормонов. Важнейшими вехами на пути появления такого раздела науки, как протеомика, стали разработка метода разделения белков при помощи гель-электрофореза в денатурирующих условиях (U.K. Laemmli, 1970 г.) и разработка двумерного электрофореза (P.H. O’Farrel и J. Klose, 1975 г.), когда были получены первые протеомные карты.

Существенная роль в протеомном анализе принадлежит методу масс-спектрометрии. Эра масс-спектрометрии макромолекул, в том числе белков, началась с разработки метода ионизации молекул электрораспылением (J.B. Fenn, 1984 г., Нобелевская премия по химии 2002 г.). Масс-спектроскопия — это метод идентификации белков, основанный на формировании в вакуумном пространстве ионизированных частиц анализируемого вещества с последующим определением отношения массы ионов к их заряду, что позволяет определить молекулярную массу, формулу, строение вещества. Последние два десятилетия ознаменовались бурным развитием этого направления, включая разработку метода MALDI (matrix-assisted laser desorption ionisation, или опосредованная матрицей лазерная десорбция-ионизация), построение масс-спектрометрических пептидных карт (пептидный фингерпринт, или дактилоскопия), появление поисковых программ для идентификации белков масс-спектрометрией по геномным последовательностям.

Совершенствование метода масс-спектрометрии (возникновение скорострельной, тандемной масс-спектрометрии) привело к широкому использованию этой технологии в протеомике. В 2012—2014 гг. скорострельная протеомика достигла уровня идентификации около 10 тыс. белков человека в одном образце; в 2014 г. опубликованы первые результаты по полной расшифровке протеома человека (A. Pandey и B. Küster).

С помощью методов масс-спектрометрии разработан проект протеома человека (ProteomicsDB) и сформирована общедоступная база данных с возможностью анализа больших данных в реальном времени. Информация, собранная при анализе совокупности белков из человеческих тканей, клеточных линий и жидкостей организма, позволила оценить размер кодирующего белки генома, выявить органоспецифические белки, а также большое количество так называемых linc РНК (long intervening non-coding RNAs). Таким образом, ProteomicsDB обеспечивает навигацию по протеомам, предоставляет биологическую информацию и способствует развитию протеомных технологий. В настоящее время метод масс-спектрометрии достаточно активно применяется в научных исследованиях [10—12], однако его широкое внедрение в практику, в частности медицинских исследований, ограничено высокой стоимостью оборудования и отчасти отсутствием достаточного количества высококвалифицированных специалистов-операторов.

Все бóльшую популярность на современном этапе приобретают высокотехнологичные методы протеомного анализа, основанные на использовании микрочипов. Интересно, что первые белковые микрочипы появились еще до разработки ДНК-микрочипов, но в силу длительности процесса их совершенствования они начали завоевывать область применения в лабораторной практике относительно недавно [13]. С тех пор микрочипы, содержащие синтетические или рекомбинантные белки и пептиды, отдельные фрагменты антител и моноклональные или поликлональные антитела на плоских поверхностях, стали важным инструментом протеомных исследований и успешно применяются для идентификации, количественной оценки и функционального анализа белков в фундаментальных и прикладных протеомных исследованиях [14].

Важность изучения белков заключается в том, что они отражают происходящие в организме процессы. Геном человека, содержащий порядка 25—30 тыс. генов, достаточно стабилен и дает информацию о функциональном потенциале организма, тогда как протеом динамичен и отражает реальные биологические процессы, происходящие в организме [15].

Созданные в ходе секвенирования генома человека технологии, в том числе микрочипы, адаптированы для использования в протеомике. Метод протеомного профилирования образцов сыворотки с применением микрочиповой технологии на основе антител (protein-antibody microarray) является полноценной, удобной и относительно экономичной альтернативой анализу протеома с помощью различных вариантов масс-спектрометрии и используется для поиска специфических маркеров диагностики заболеваний, оценки эффективности терапии, исследования сигнальных путей и т.д. Метод основан на использовании готовых микрочипов (матриц) и предназначен для одновременного анализа широкого спектра белковых и пептидных компонентов в любой биологической жидкости [14—16]. Иными словами, белковые микрочипы — это платформы для изучения белок-белковых взаимодействий и выявления биомаркеров заболеваний в высокопроизводительном формате [17, 18].

По мере развития технологий, позволяющих улучшать качество специфичных антител против разнообразных белков и снижать затраты на их очистку, более совершенные микрочипы вышли на новую спираль развития и начали привлекать интерес исследователей в качестве инструмента для относительно экономичного единовременного анализа большого количества белковых молекул в минимальных объемах сыворотки крови и других биологических жидкостей [19, 20]. Хотя основная доля изготавливаемых в настоящее время биочипов приходится на ДНК-чипы (94%), белковые чипы, составляющие оставшиеся 6%, — современная, бурно развивающаяся технология, получающая все более широкое применение в диагностической и клинической медицине.

В настоящее время в арсенале исследователей имеется множество различных коммерчески доступных аналитических платформ с различными характеристиками, включая технологию изготовления микрочипа [18, 21], количество анализируемых белков и способы их детекции, тип поверхности микрочипа и т.п. [17, 22—24]. Однако расшифровка различий между этими платформами не всегда проста, а анализ и интерпретация большого объема информации, получаемой с помощью микрочипов, остаются сложной задачей. В обзоре, выполненном J.G. Duarte и J.M. Blackburn (2017), рассмотрены технологические основы применения и ограничения некоторых наиболее часто используемых платформ различных производителей для детекции полноразмерных рекомбинантных белков и белковых фрагментов, включая ProtoArray Human Protein Microarrays, HuProt Human Proteome Microarrays, Human Protein Atlas Protein Fragment Arrays, Nucleic Acid Programmable Arrays и Immunome Protein Arrays [25]. Авторы приходят к заключению, что выбор подходящей микрочиповой платформы зависит от конкретной исследовательской задачи. Так, микрочипы, предназначенные для анализа полноразмерных белков, обладают определенным преимуществом при профилировании, например сыворотки крови, с целью поиска новых биомаркеров.

Область протеомики претерпевает быстрый прогресс: появились белковые микрочипы различных типов, тканевые, лектиновые и бесклеточные экспрессионные микрочипы, которые находят широкое применение в протеомных исследованиях, включая обнаружение биомаркеров, изучение взаимодействия белков, профилирование ферментов и субстратов, иммунологическое профилирование, разработку вакцин и т.д. [26].

Ключевым моментом для получения репрезентативных и воспроизводимых результатов является тщательная разработка эксперимента. Крайне важно, чтобы выбранный продукт был надежен в эксплуатации и при соблюдении инструкции производителя гарантировал результат, адекватный заявленным характеристикам. Однако опыт показывает, что такое бывает не всегда. Стоимость микрочипов достаточно высока, чтобы перебирать продукты разных фирм-производителей вслепую и наугад, поэтому информация о том, насколько успешны были те или иные виды чипов для решения конкретных задач в реальной лабораторной практике, весьма полезна для исследователей и может помочь сэкономить их силы, время и средства [13, 27].

Микрочип — это высококачественный стеклянный (пластиковый, гелевый или кремниевый) слайд, обычно размером 76×25×1 мм, покрытый 3D-полимером с ковалентно-иммобилизованными моноклональными антителами, которые избирательно связывают соответствующие белки, содержащиеся в исследуемом биообразце. В настоящее время относительно широко используются три типа белковых микрочипов: аналитические, функциональные и обратно-фазовые [28—31].

Аналитические микрочипы представляют собой матрицу с иммобилизованными антителами к различным белкам; их применяют для профилирования сложных белковых смесей, в том числе для сравнительного анализа, например у больных и здоровых [29, 31].

Функциональные микрочипы отличаются от аналитических тем, что на твердой матрице располагаются биологически активные белки (например, ферменты) или их домены. С помощью таких микрочипов в одном эксперименте можно анализировать биохимическую/функциональную активность белка, а также изучать различные белок-белковые и другие взаимодействия (с ДНК, РНК, липидами, низкомолекулярными лигандами) [32].

Обратно-фазовые микрочипы — это технологическая платформа, предназначенная для количественного, мультиплексного анализа специфических форм клеточных белков. Термин «обратная фаза» означает, что в качестве «молекулы захвата» на матрице иммобилизуется не антитело, а аналит (антиген) [33]. Микрочипы этого типа могут использоваться для исследования образцов (срезов) тканей, клеток, сыворотки крови и других биологических жидкостей организма с целью оценки функционального состояния важнейших сигнальных путей. Ранее эта технология была лишь исследовательским инструментом, теперь ее используют в клинических исследованиях с чувствительностью и точностью, достаточной для клинической оценки биомаркера [34].

В исследованиях, проводимых в ФГБУ «НМИЦ ТПМ» Минздрава России, использована и апробирована высокотехнологичная методика протеомного анализа сыворотки крови с применением микрочипов Explorer Antibody Microarray ASB600 (Full Moon BioSystems, Inc., США) с возможностью анализа 656 белков в двух копиях. Технология проведения эксперимента описана в наших предыдущих работах [13, 27]. Вкратце методика включает несколько этапов: подготовку образцов сыворотки крови; мечение белков сыворотки с помощью флуоресцентного красителя (Arrayit Green 540); гель-фильтрацию для удаления несвязавшегося красителя; подготовку микрочипа (инкубацию слайда с блокирующим раствором); гибридизацию, т.е. инкубацию сыворотки, содержащей меченые белки, со специальным реагентом (coupling solution) с последующей промывкой и высушиванием слайда; сканирование микрочипов на лазерном сканере (InnoScan, Франция). После загрузки GAL-файлов и настройки решетки в ручном режиме с ориентацией по положительным контролям проводится анализ изображения с помощью программы MAPIX Software, позволяющей получить до 25 разнообразных характеристик пятен, в том числе с вычетом фона, и идентифицировать каждое пятно как конкретный белок.

Перечень белков, предназначенных для определения с помощью микрочипов, содержится в соответствующих GAL-файлах, которые доступны для скачивания на сайте компаний-производителей. Аббревиатура GAL образована начальными буквами исторически сложившегося названия списка компонентов: GenePix Array List; ныне эта аббревиатура укоренилась как термин, обозначающий базу анализируемых белков.

Идентификацию белков осуществляют с помощью доступных баз данных (архивных, курируемых, производных, интегрированных), представленных в виде различных вариантов на соответствующих сайтах [31]. В качестве оптимального варианта следует рассматривать курируемые базы данных, которые контролируются представителями сайта, поэтому попадание случайной информации (как, например, в случае архивных баз) практически исключено. Среди наиболее известных баз данных этой группы можно назвать SWISS-PROT [35], которая доступна на сайтах https://www.expasy.ch/sprot и https://www.ebi.ac.uk/swissprot. База хорошо аннотирована, т.е. содержит описание функций белков, структуры их доменов, посттрансляционных модификаций, вариантов и т.д.), имеет минимальный уровень избыточности и высокий уровень интеграции с другими базами данных. Еще одним универсальным источником данных является база данных UniProt [36].

Важным этапом протеомных исследований является биоинформатический анализ с полуколичественной оценкой и валидацией связи белкового профиля с патологией (например, с коронарным атеросклерозом): либо с помощью 2D-гель-электрофореза или иммуноферментного анализа (при наличии соответствующих наборов или использовании метода Home ELISA), либо с помощью western blotting при наличии соответствующих антител, либо по взаимодействию белков с моноклональными антителами.

Причина большинства болезней человека кроется в функциональной дисрегуляции белковых взаимодействий, поэтому понимание роли, которую играют белковые сети в развитии заболеваний, открывает огромные клинические перспективы, поскольку мишенью для лекарственных воздействий могут стать крупные метаболические звенья или целые клеточные сети, а не только один дисрегуляторный белок. Следующим технологическим скачком может стать применение протеомных технологий непосредственно у постели больного, поскольку появится возможность анализировать состояние белковых сигнальных путей в измененных болезнью клетках до, в процессе и после терапии, что фактически отражает появление истинно индивидуальной (персонализированной) терапии для пациента [37], а успех персонализированной медицины зависит от правильности выявления пациента, которому необходимо лечение.

Немногим более 10 лет назад исследования на основе белковых микрочипов перешли от технологической направленности к прикладной, возникла отдельная область исследования — клиническая протеомика [38]. Белковые микрочипы — идеальный инструмент для изучения хронических неинфекционных заболеваний, поскольку они предназначены для: обнаружения белковых биомаркеров не только различных заболеваний, но и разных их стадий; оценки потенциальной эффективности и токсичности препаратов в доклинических испытаниях; изучения различий в синтезе белков различными типами клеток, клетками, находящимися на разных стадиях развития, а также здоровыми и патологически измененными клетками; анализа взаимосвязи между структурой и функциями белков и изучения взаимодействий между белками и другими молекулами; оценки различий в экспрессии белков с целью выявления мишеней для новых лекарственных препаратов. Это крайне актуально для коморбидных пациентов различных возрастных групп, имеющих большой спектр сочетанных заболеваний (ССЗ, связанные с атеросклерозом, метаболический синдром и сахарный диабет, артериальная гипертензия, хроническая сердечная недостаточность, аритмии, хроническая болезнь почек, патология желудочно-кишечного тракта и др.).

Появление многопараметрических тест-систем, основанных на микрочиповых технологиях, связано с работами и отечественных, и зарубежных ученых. На первых этапах исследования были направлены на поиск и анализ маркеров различных онкологических заболеваний. В настоящее время протеомные исследования проводятся в различных областях клинической медицины: в кардиологии [39—41], онкологии [42—44], неврологии, эндокринологии, дерматологии и венерологии, офтальмологии, в акушерстве и гинекологии и др. [9, 45], а также при изучении аутоиммунных заболеваний [46]. Белковые микрочипы позволяют одновременно анализировать экспрессию десятков сигнальных молекул, таких как цитокины и хемокины, участвующих в регуляции иммунной системы; с их помощью удается обнаружить новые классы аутоантител, которые вызывают аутоиммунные заболевания; иммунопротеомика изучает белки и пептиды в качестве кандидатов на создание вакцин [47].

Таким образом, клиническая протеомика — это идентификация и количественное определение всех индивидуальных белков, которые содержатся в биологическом образце (сыворотке крови, спинномозговой жидкости, моче, ткани), и мониторинг изменения их концентраций, что позволяет осуществлять диагностику и отслеживать течение заболевания.

Последние разработки в области протеомики открывают новые возможности для клинического применения протеомного анализа, включая идентификацию новых биомаркеров, мониторинг заболеваний, выявление побочных эффектов лекарств и экологических опасностей.

К настоящему времени в литературе опубликован целый ряд статей, посвященных описанию технологий разработки и применения микрочипов, включая работы отечественных исследователей [18, 43], и результатам поиска белковых детерминант, которые могут претендовать на роль новых биомаркеров различных заболеваний, в том числе ССЗ [41, 48]. В обзоре Е.М. Стахневой и соавт. [49] представлен подробный анализ публикаций по вопросам протеомного анализа сыворотки крови и сосудистой стенки у больных атеросклеротическими ССЗ, а также отмечено особое внимание, которое уделяется вопросам протеомного анализа на представительных международных форумах, что еще раз подчеркивает актуальность исследований в этом направлении. Показана специфика протеомного профиля сыворотки крови у больных ишемической болезнью сердца на фоне коронарного атеросклероза, у пациентов с острым коронарным синдромом и инфарктом миокарда, атеросклерозом сонных артерий и мозговым инсультом в сравнении с лицами без соответствующей патологии; идентифицированы белки / группы белков, сосудистого внеклеточного матрикса и тромбоцитов больных с пораженными артериями разной выраженности [40, 49]; описаны специфические и общие белки различных слоев сосудистой стенки [48]. С помощью протеомного анализа обнаружен ряд белков, ассоциированных с атеросклеротическими бляшками [50], в том числе нестабильными [39, 51].

Важным моментом в ходе протеомного анализа является и обнаружение различных форм одного и того же белка. Так, с помощью сочетания методов 2D-электрофореза и масс-спектрометрии удалось показать, что в сыворотке крови больных имеет место изменение не только концентрации, но и соотношения изоформ транстиретина с преобладанием мономерной формы [41, 48, 49].

В ходе проведенных нами исследований выполнена серия работ по подбору оптимальных условий для протеомного профилирования сыворотки крови, включая сравнение микрочипов разных производителей, оценку воспроизводимости метода, анализ вариаций времени инкубации сыворотки крови с мечеными белками. Показано, что исследования по обнаружению маркеров должны проводиться на моделях заболеваний в виде небольших хорошо фенотипированных групп с максимально одинаковыми характеристиками сравниваемых субъектов, что позволит получить информативные данные о протеомном профиле сыворотки крови [13, 27].

Следует отметить, что кровь является прекрасным источником для обнаружения новых биомаркеров, однако протеомные исследования плазмы или сыворотки крови затруднены наличием белков с высокой концентрацией, таких как альбумин или иммуноглобулины, которые могут маскировать другие белки, присутствующие в более низких концентрациях [40]. Используя адекватные методы, можно удалить эти мажорные белки, но этот подход не лишен риска, поскольку удаление альбумина из биообразца может привести к удалению связанных с ним белков. Проведенные нами эксперименты по предварительному удалению из плазмы мажорных белков (альбумина и IgG) показали отсутствие необходимости их удаления, поскольку это не приводит к существенному увеличению уровня минорных фракций белков и одновременно вызывает избыточное разведение образцов, требующее дальнейшего концентрирования (Н.Г. Гуманова, 2022, неопубликованные данные).

Если рассматривать совокупность всех белков отдельных тканей, клеток или клеточных органелл, правильнее говорить о части протеома, или субпротеоме; в качестве примера можно привести цитопротеом [52], т.е. белковый состав отдельных клеток, включая клетки крови, а также секретóм, т.е. комплекс белков, секретируемых, например, эндотелиальными или гладкомышечными клетками в кровоток [39].

Еще одним примером субпротеома могут служить белки липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) [53]. В ходе многочисленных исследований с использованием различных методик получены данные о протеоме ЛПВП, содержащие намного больше информации о свойствах и функции ЛПВП, чем те, что получают при определении уровня холестерина в их составе. Обнаружено, что ЛПВП транспортируют более 250 белков, которые выполняют различные физиологические функции или потенциально вовлечены в атерогенез и могут быть маркерами атеросклеротических ССЗ и/или мишенями терапии [54, 55].

Главная задача протеомики — исследование белкового профиля, характерного для нормального физиологического состояния организма или ассоциированного с той или иной патологией. Перспективным направлением в рамках развития биомедицины представляется проведение протеомного анализа среди лиц различного пола и возраста без клинических проявлений заболевания — формирование типичного контрольного протеомного профиля, а также среди пациентов с верифицированной (клинически/инструментально/лабораторно) хронической патологией — формирование типичного патологического протеомного профиля для каждого конкретного заболевания. Построение типичных протеомных профилей, выявление с их помощью ключевых специфических белковых детерминант наличия и степени выраженности заболевания, их валидация и оценка диагностической значимости станет основой для формирования диагностических комплексов (диагностических панелей / биохимических тестов). Такие комплексы, сформированные на основе биотехнологических стратегий, позволят выявлять пациентов высокого риска развития ХНИЗ, стратифицировать/реклассифицировать пациентов в соответствующие группы риска, что необходимо в целях развития персонализированной медицины. С использованием технологии Proximity Extension Assay (Olink Proteomics AB, Нидерланды) показано, что целевой протеомный подход превосходит прогностическую значимость традиционных факторов риска атеросклеротических ССЗ в условиях первичной профилактики [56, 57]. С учетом высокой вероятности рецидива этих заболеваний актуален и поиск биомаркеров для выявления пациентов высокого риска и в рамках вторичной профилактики [58].

Итак, белковые микрочипы предназначены для: обнаружения белковых биомаркеров различных заболеваний и даже разных их стадий (маркеров-кандидатов); валидации биомаркеров; оценки потенциальной эффективности и токсичности препаратов в доклинических испытаниях; измерения различий в синтезе белков различными типами клеток; изучения взаимосвязи между структурой и функциями белков; оценки различий в экспрессии белков с целью выявления мишеней для новых лекарственных препаратов; изучения взаимодействий между белками и другими молекулами.

Идентификация пациентов, относящихся к группе повышенного риска развития сердечно-сосудистых заболеваний, остается важнейшей проблемой современной биомедицинской науки. Классические факторы риска обладают невысокой прогностической значимостью на индивидуальном уровне, а многие молекулы, рассматриваемые в качестве потенциальных биомаркеров, так и не вошли в рутинную клинико-лабораторную практику. Протеом плазмы крови, предположительно, включает 20 тыс. белков, из них идентифицировано около 850 белков, а концентрация измерена только для нескольких десятков из них [7]. Учитывая тот факт, что время от обнаружения потенциального маркера до создания коммерчески доступного набора составляет примерно 10 лет, исследование такого массива белков с помощью традиционных методов представляется нереальной задачей.

Среди приоритетных направлений, изложенных в «Перечне критических технологий Российской Федерации» (2011 г.), имеется позиция «Геномные, протеомные и постгеномные технологии», что свидетельствует о важности и востребованности исследований в этой области. В связи с этим усилия ученых на современном этапе направлены на разработку и внедрение технологий, позволяющих осуществлять поиск биомаркеров на основе протеомного анализа, который стал важной частью биологических и клинических исследований.

Тот факт, что микрочипы завоевали популярность в молекулярной биологии и биомедицинских науках, сегодня неоспорим. Обзоры, описывающие эту технологию, регулярно публикуются в ведущих научных журналах. Десятки компаний производят микрочипы, а рынок микрочипов ежегодно приносит сотни миллионов долларов.

Протеомный анализ с использованием микрочиповой технологии состоит из нескольких ключевых этапов: 1) выбор так называемых фокус-групп, включающих пациентов с той или иной патологией и лиц контрольной группы, не имеющих по крайней мере клинических признаков заболевания; формируемые группы (достаточно малочисленные в связи с высокой стоимостью реагентов) должны быть максимально однородны (по полу, возрасту, профилю факторов риска и лекарственной терапии); 2) проведение протеомного анализа и выбор целевых белков (биомаркеров-кандидатов), которые в наибольшей степени позволяют отличить сравниваемые группы друг от друга; 3) тестирование (валидация) избранных биомаркеров-кандидатов с помощью количественных методов анализа; 4) тестирование (верификация) биомаркеров на независимых когортах или в рамках проспективных наблюдений за исходными выборками.

Результатом протеомного анализа будет построение протеомных профилей, выявление с их помощью ключевых специфических белковых детерминант наличия и степени выраженности заболевания, их валидация и оценка диагностической значимости как основы для формирования диагностических комплексов (панелей/тестов).

Еще одним перспективным направлением может стать комплексный анализ протеомного профиля и ключевых метаболических показателей в сыворотке крови, а также их различных комбинаций в качестве мультимаркерных индикаторов, характеризующих различные стадии развития патологического процесса, т.е. разработка вариантов мультиплексного определения различных белков и метаболитов в одном биологическом образце [59, 60]. Применение методов машинного обучения позволит врачам интерпретировать огромные массивы получаемых в результате протеомных анализов данных, которые невозможно проанализировать с помощью традиционных статистических методов. Таким образом, есть все основания полагать, что протеомные технологии позволят проводить анализ молекулярного состава биологического материала для оценки рисков возникновения и ранней диагностики социально значимых и профессионально обусловленных заболеваний.

Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.