Применение рекомбинантной гиалуронидазы в протоколах вспомогательных репродуктивных технологий

Метод интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит (ИКСИ) разработан для преодоления мужского фактора бесплодия и в настоящее время считается «золотым стандартом» оплодотворения в этой ситуации [1]. В то же время показания к его применению неуклонно расширяются. Так, целесообразно применять ИКСИ при предыдущих неудачах оплодотворения с помощью стандартного метода экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) [2, 3], поскольку отсутствие оплодотворения может быть связано с нарушением рецептивности мембраны ооцита [4—7]. Ведется немало споров о положительном влиянии ИКСИ на исходы программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) у женщин старшего репродуктивного возраста [8, 9], обсуждается повышение кумулятивной частоты беременности у данных пациенток [10—13]. Активно обсуждается применение ИКСИ при наличии у женщины наружного генитального эндометриоза [3].

Перед процедурой ИКСИ клетки кумулюса необходимо отделить от ооцита. Данный этап является чрезвычайно важным, поскольку бережная денудация ооцитов — это залог успеха дальнейшего оплодотворения [14—20]. Обычно это достигается ферментным расщеплением матрикса бычьей гиалуронидазой с последующей денудацией с помощью пипетирования. Однако безопасность гиалуронидазы животного происхождения остается поводом для обсуждения [4, 21, 22]. Бычья гиалуронидаза может вызывать необъяснимое разрушение комплекса «ооцит—кумулюс» (ОКК) при длительном воздействии фермента на ОКК или при высокой ее концентрации [22, 23]. Обработка гиалуронидазой приводит к разрушению гиалуронового матрикса, окружающего ОКК, и отделению кумулюсных клеток от ооцита [24]. В некоторых работах сообщается, что денудация ооцитов с помощью гиалуронидазы снижает качество клеток и уровень фертилизации при ИКСИ, однако причины такого влияния фермента до конца не понятны [23, 25]. Высказано предположение, что применение бычьей гиалуронидазы повышает риск контаминации яйцеклеток и среды патогенами животного происхождения, что может влиять на качество яйцеклеток и дальнейшее эмбриональное развитие [23].

Альтернативой является применение рекомбинантной гиалуронидазы человека, которая обладает рядом преимуществ: имеет человеческое происхождение и является химически чистым продуктом. Рекомбинантная гиалуронидаза человека безопасна в высоких концентрациях, и время ее экспозиции не столь критично. По данным исследований, при ее использовании значительно повышается уровень нормального оплодотворения и снижается частота повреждения ооцитов [21, 23, 26, 27].

Предполагается, что рекомбинантная гиалуронидаза человека является безопасным продуктом и обладает более высокой эффективностью по сравнению с бычьей гиалуронидазой [21, 23, 26, 28]. K. Furuhashi и соавт. в сравнительном анализе циклов ЭКО-ИКСИ показали, что применение рекомбинантной гиалуронидазы повышает уровень фертилизации и частоту образования бластоцист хорошего качества [4]. Однако результаты исследований влияния рекомбинантной гиалуронидазы на частоту наступления клинической беременности и рождения живого ребенка в настоящее время являются противоречивыми [29].

Цель исследования — оценить влияние типа фермента, используемого для денудации ОКК, на образование бластоцист и частоту наступления беременности.

Ретроспективное одноцентровое исследование в параллельных возрастных группах.

В исследование включено 252 цикла ЭКО-ИКСИ и 433 цикла ЭКО (контрольная группа). Пациентки разделены на две опытные группы в зависимости от способа денудации ОКК: у пациенток 1-й группы использована бычья гиалуронидаза (n=112), у пациенток 2-й группы — человеческая рекомбинантная гиалуронидаза (n=140).

Отбор производили на этапе вступления пациентки в программу ЭКО в соответствии с Приказом Минздрава России от 30.08.12 №107н «О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению». В исследование включены пациентки с мужским или сочетанным фактором бесплодия, которым показано проведение ИКСИ.

В исследование включены лечебные циклы, проведенные в отделении вспомогательных репродуктивных технологий ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр им. В.А. Алмазова» Минздрава России в 2015—2017 гг.

Индукцию суперовуляции начинали на 2—3-й день менструального цикла с использованием протокола с антагонистами гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ). Для стимуляции суперовуляции использовали препараты рекомбинантных или мочевых гонадотропинов, дозу препарата подбирали индивидуально на основании возраста пациентки, данных гормонального и ультразвукового исследований и варьировали в пределах 150—300 МЕ в сутки. Продолжительность индукции суперовуляции составляла 10—12 дней, она заканчивалась введением триггера овуляции — хорионического гонадотропина. При росте более 16 фолликулов проводилась замена триггера агонистом ГнРГ, данные циклы исключались из анализа.

Через 36 ч после введения триггера выполняли трансвагинальную пункцию фолликулов под ультразвуковым контролем. В исследование включены пациентки, у которых получено 5 и более ОКК. Полученные ОКК отмывали от клеток крови и фолликулярной жидкости в среде FLUSH (ORIGIO a/s, Дания) и культивировали до оплодотворения в среде IVF (ORIGIO a/s, Дания) при 37°C в атмосфере 6% СО₂.

Денудацию ОКК с помощью бычьей (Hyadase, ORIGIO a/s, Дания) или рекомбинантной (Cumulase, ORIGIO a/s, Дания) гиалуронидазы осуществляли через 1,5—2 ч после пункции. Время экспозиции ОКК в рекомбинантной гиалуронидазе составляло 60 с, в бычьей — 20 с. Затем ооциты денудировали механически с помощью пипетирования капилляром Stripper ORIGIO 150 µm.

Оплодотворение проводили методом ИКСИ, используя стандартную методику [30]. Через 16—20 ч оценивали оплодотворение ооцитов. Культивация эмбрионов продолжалась до 5 сут. Перенос эмбрионов в полость матки проводили на 5-е сутки культивации.

Методом рандомизации пациентки разделены на две опытные группы в зависимости от способа денудации ОКК: у пациенток 1-й группы использована бычья гиалуронидаза (n=112), у пациенток 2-й группы — человеческая рекомбинантная гиалуронидаза (n=140). Далее пациентки распределены в четыре возрастные группы: до 30 лет (198 женщин), 31—35 лет (242 женщины), 36—38 лет (107 женщин) и старше 39 лет (56 женщин).

Оценка уровня бластуляции и выхода бластоцист хорошего качества производилась на 5-й день развития in vitro. Классификация эмбрионов на стадии бластоцисты проведена согласно рекомендациям D. Gardner [29]. К эмбрионам топ-качества относили бластоцисты со степенью экспансии 3—5 при качестве эмбриобласта и трофобласта А и В.

Регистрация факта наступления беременности осуществлялась по результатам анализа крови на хорионический гонадотропин на 10-е сутки после переноса эмбрионов, а также по результатам ультразвукового исследования на наличие плодного яйца через 6 нед после переноса эмбрионов в полость матки пациентки.

Исследование выполнено в соответствии со стандартами надлежащей клинической практики (Good Clinical Practice) и принципами Хельсинкской декларации. Протокол исследования одобрен этическим комитетом ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр им. В.А. Алмазова» Минздрава России. До включения в исследование ото всех участников получено письменное информированное добровольное согласие.

Статистический анализ данных с подсчетом медианы, среднего, стандартного отклонения, стандартной ошибки среднего осуществлен с помощью пакета прикладных программ Statistica v. 7. Различия между непараметрическими переменными выявляли при помощи непараметрических критериев Краскела—Уоллиса и Манна—Уитни.

Всего проанализировано 685 циклов ВРТ. Группы пациентов, которые получали курс лечения в рамках протоколов ЭКО и ЭКО-ИКСИ, не различались между собой по возрасту (средний возраст составил 32,6±4,17 года; p=0,4117) и показателям овариального резерва (количеству антральных фолликулов, уровню фолликулостимулирующего гормона, уровню антимюллерова гормона). Следует отметить, что опытная и контрольная группа пациентов не различались между собой по количеству полученных ОКК (0,84±0,17 по сравнению с 0,88±0,12; p=0,55) и числу перенесенных эмбрионов в полость матки (1,76±0,43 против 1,77±0,43; p=0,66).

Анализ протоколов ЭКО-ИКСИ показал, что во всех возрастных группах применение рекомбинантной гиалуронидазы не оказывало влияния на уровень бластуляции. В табл. 1 представлены результаты циклов ЭКО и ЭКО-ИКСИ, где были получены 1 и более бластоцисты. При использовании рекомбинантной гиалуронидазы выявлена тенденция к повышению количества бластоцист хорошего качества. В этой группе частота выхода бластоцист топ-качества оказалась выше на 12,5% по сравнению группой, в которой использована бычья гиалуронидаза. Однако различия не достигли статистической значимости (p=0,3367). Частота наступления беременности оказалась одинаковой во всех группах исследования.

Таблица 1. Уровень бластуляции в группах исследования

Примечание. * — p<0,05. Группа 0 — контроль; группа 1-я — в протоколах применена бычья гиалуронидаза; группа 2-я — в протоколах применена рекомбинантная гиалуронидаза.

Далее пациентки распределены в четыре возрастные группы: до 30 лет (195 женщин), 31—35 лет (204 женщины), 36—38 лет (233 пациентки) и старше 39 лет (53 человека). В каждой возрастной группе выполнен анализ результативности проведенных циклов ВРТ по эмбриологическим показателям: уровням фертилизации, бластуляции, образования бластоцист хорошего качества и частоте наступления беременности.

Результаты исследования показали, что применение рекомбинантной гиалуронидазы для очистки ОКК во всех возрастных группах не повлияло на уровень фертилизации и частоту бластуляции (табл. 2—5).

Таблица 2. Результаты анализа изучаемых показателей в группе пациенток до 30 лет в зависимости от метода оплодотворения

Примечание. ЭКО — экстракорпоральное оплодотворение; БГ — бычья гиалуронидаза; РГ — рекомбинантная гиалуронидаза.

Таблица 3. Результаты анализа изучаемых показателей в группе пациенток 31—35 лет в зависимости от метода оплодотворения

Примечание. ЭКО — экстракорпоральное оплодотворение; БГ — бычья гиалуронидаза; РГ — рекомбинантная гиалуронидаза.

Таблица 4. Результаты анализа изучаемых показателей в группе пациенток 36—38 лет в зависимости от метода оплодотворения

Примечание. * — p<0,05. ЭКО — экстракорпоральное оплодотворение; БГ — бычья гиалуронидаза; РГ — рекомбинантная гиалуронидаза.

Таблица 5. Результаты анализа изучаемых показателей в группе пациенток 39—43 лет в зависимости от метода оплодотворения

Примечание. * — p<0,05. ЭКО — экстракорпоральное оплодотворение; БГ — бычья гиалуронидаза; РГ — рекомбинантная гиалуронидаза.

Уровень образования эмбрионов хорошего качества и частота наступления беременности не зависели от метода оплодотворения и способа очистки ОКК у женщин до 36 лет. У пациенток 36—38 лет выявлено статистически значимое повышение частоты наступления беременности при применении рекомбинантной человеческой гиалуронидазы по сравнению с пациентками опытной группы, в которой применена бычья гиалуронидаза (64,0% по сравнению с 48,6%; p<0,05). При этом в контрольной группе уровень наступления беременности составлял 57,14%, что выше на 8,54%, чем в опытной группе, в которой применялась бычья гиалуронидаза, однако ниже на 6,86%, чем в группе, в которой для денудации клеток перед ИКСИ использована рекомбинантная гиалуронидаза. Однако различия статистически незначимы.

У пациенток старшей возрастной группы (>39 лет) также получены интересные результаты (см. табл. 5). Во-первых, частота наступления беременности в группах, в которых использована методика ИКСИ, была статистически значимо выше, чем при проведении классического ЭКО. Во-вторых, выявлено увеличение уровня образования бластоцист хорошего качества при денудации ОКК с помощью рекомбинантной гиалуронидазы на 19% (0,12±0,22 по сравнению с 0,31±0,35; p<0,05). При этом частота наступления беременности у этих пациенток оказалась ниже, чем у пациенток группы, в которой применялась бычья гиалуронидаза (44% по сравнению с 50%, p<0,05).

В ходе проведения исследования нежелательные явления не зарегистрированы.

Задачей нашей работы являлся анализ эффективности применения рекомбинантной человеческой гиалуронидазы для денудации яйцеклеток при подготовке к процедуре ИКСИ. Оценивалось, насколько бережно данный реагент очищает ооцит от клеток кумулюса и степень его механического воздействия на яйцеклетку, поскольку это является критическим этапом при получении эмбрионов in vitro с помощью ИКСИ.

Анализ данных литературы показал, что применение рекомбинантной гиалуронидазы снижает уровень атрезии при оплодотворении в 3,3 раза и повышает уровень фертилизации ооцитов по сравнению с денудацией с помощью бычьей гиалуронидазы [21, 26]. Предполагается, что рекомбинантная гиалуронидаза обеспечивает менее травматичное расщепление контактов между кумулюсными клетками и ооцитом, что снижает уровень повреждения яйцеклетки, увеличивая шансы успешного оплодотворения [4, 23]. Снижение риска повреждений ооцитов особенно важно, когда при пункции фолликулов пациентки получено мало ОКК. Однако в нашем исследовании не обнаружено влияния типа гиалуронидазы на частоту фертилизации и бластуляции, что согласуется с данными N. Tsampras и соавт. [28].

При анализе возрастных групп выявлено, что у женщин 36—38 лет частота наступления беременности при применении рекомбинантной гиалуронидазы выше, чем при использовании бычьей гиалуронидазы. Однако у женщин 39 лет и старше ситуация оказалась противоположной, несмотря на то что при использовании рекомбинантной гиалуронидазы бластоцисты хорошего качества получены статистически значимо чаще. При этом увеличение числа бластоцист хорошего качества, которое наблюдается при применении рекомбинантной гиалуронидазы, может иметь клиническое значение, так как способствует криоконсервации большего числа эмбрионов. В рамках данной работы мы не оценивали частоту криоконсервации и кумулятивную частоту наступления беременности у этой категории женщин, и это представляет интерес для дальнейшего исследования.

Следует отметить, что у пациенток старшей возрастной группы (39 лет и старше) после проведения ИКСИ частота наступления беременности оказалась выше, чем после проведения стандартного ЭКО. Это согласуется с данными, приведенными в работе N. Nikolettos и соавт. [9]. Однако необходимо более детальное изучение влияния метода оплодотворения на исход программ ЭКО в зависимости от возраста женщины.

Результаты нашего исследования показали, что тип используемой гиалуронидазы не оказывал влияния на частоту фертилизации ооцитов, уровень бластуляции и частоту наступления беременности. Выявлены две возрастные категории пациенток, в которых применение рекомбинантной гиалуронидазы может иметь преимущества: у пациенток 36—38 лет отмечена более высокая частота наступления беременности, а у женщин 39 лет и старше — более высокая частота получения бластоцист топ-качества.

Тип гиалуронидазы, используемой для денудации ооцитов перед процедурой ИКСИ, не оказывал влияния на частоту фертилизации ооцитов, уровень бластуляции и частоту наступления беременности.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Скотти О.С., Горелова И.В.

Сбор и обработка материала — Скотти О.С., Кибардина Т.В., Игнатович И.А., Рулев М.В.

Статистический анализ данных — Скотти О.С.

Написание текста — Скотти О.С., Кибардина Т.В.

Редактирование — Кибардина Т.В., Горелова И.В.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.