Введение

Фолатный цикл с позиции его роли в раннем онтогенезе является важным процессом, обеспечивающим жизнедеятельность плода, плаценты и материнского микроокружения [1]. Он объединяет в себя два внутриклеточных циклических процесса. Для эффективной работы этих двух циклов (тетрагидрофолат-метилтетрагидрофолат и метионин-гомоцистеин) необходима слаженная работа как минимум трех ферментов MTHFR, MTR и MTRR. Одним из достаточно изученных последствий снижения активности MTHFR, MTR и MTRR является гипергомоцистеинемия, которая является составляющей отдельных звеньев патогенеза репродуктивных потерь и врожденных пороков плода, в том числе сердечно-сосудистой системы [2—4]. В отношении механизмов влияния гипергомоцистеинемии на плод и на эмбриогенез сердечно-сосудистой системы высказано несколько важных версий. Так, материнский гомоцистеин, являясь серосодержащей непротеиногенной аминокислотой, может проникать в ткани эмбриона. Токсическое влияние гомоцистеина на эмбриобласт и на прогениторные клетки формирующейся сердечно-сосудистой системы связано с его безрецепторным проникновением в эти клетки с последующей активацией MAP-киназы и ассоциированного с ней апоптоза [5]. Кроме того, повышенная концентрация гомоцистеина может стимулировать в лимфоцитах материнского микроокружения эмбриона синтез провоспалительных цитокинов — фактора некроза опухоли (TNF-α) и гамма-интерферона [6]. Высокая концентрация медиаторов воспаления в системе «мать-эмбрион» также будет стимулировать пироптоз в клетках эмбриона. Формирование пороков и аномалий развития, в том числе сердечно-сосудистой системы, может определяться и дисфункцией фолатного цикла у эмбриона за счет наследования им «патологических» аллелей генов основных ферментов этих процессов. Именно эти нарушения указываются как ключевые в патогенезе аномалий и пороков развития центральной нервной системы и сердечно-сосудистой системы у плода [2].

Врожденные пороки сердца (ВПС) являются ведущей врожденной аномалией, и их частота достигает 1% у живорожденных детей. Причем частота критических ВПС увеличивается из года в год [7]. На сегодняшний день уже получены для некоторых популяций мира ассоциации полиморфных вариантов генов фолатного цикла с предрасположенностью к ВПС [2, 3, 8].

Основными генетическими маркерами риска формирования ВПС в последующем поколении могут быть широко изученные полиморфные варианты генов фолатного цикла: MTHFR (C677T), MTHFR (A1298C), MTR (A2756G), MTRR (A66G) [9—11].

Цель исследования — изучить ассоциации полиморфных локусов генов MTHFR (C677T), MTHFR (A1298C), MTR (A2756G), MTRR (A66G) с предрасположенностью к развитию ВПС.

Материал и методы

В соответствии с целью исследования в основную группу включены 179 женщин, имеющих детей с патологией развития сердца, в контрольную группу — 103 женщины, которые имели условно здоровых детей. Возраст женщин основной группы составлял от 18 до 41 года, контрольной — от 19 до 44. Группы формировали на базе ГБУЗ «Кузбасский клинический кардиологический диспансер имени академика Л.С. Барбараша», где проходили лечение дети включенных в исследование. Исследование одобрено локально этическим комитетом НИИ КПССЗ (протокол №20 от 24.11.16). Для набора основной и контрольной групп исследования использовали критерии включения и исключения, описанные нами ранее [12].

Материалом для исследования послужила геномная ДНК, выделенная из венозной крови методом фенол-хлороформной экстракции согласно протоколу. Качество и количество выделенной ДНК оценивали на спектрофотометре NanoDrop ND-2000C («Thermo Scientific», США).

В качестве потенциальных маркеров выбраны 4 полиморфных локуса в 3 генах: MTHFR (C677T, A1298C), MTR (A2756G), MTRR (A66G), типирование которых проводили методом ПЦР коммерческими наборами (ООО «ДНК-Технология», Россия) для определения метаболизма фолатов (R1-H908-N3/4, Россия).

Статистический анализ проводили с использованием программ GraphPad Prism 8.0 («GraphPad Software», США) и SNPstats (https://bioinfo. iconcologia.net/SNPstats). Проверку на соответствие равновесию Харди—Вайнберга выполняли с помощью теста χ². Для выявления ассоциаций полиморфных вариантов с развитием ВПС вычисляли значение относительного риска (ОР) и 95% доверительного интервала (ДИ).

С помощью программы MDR 3.0.2. (Multifactor Dimensionality Reduction, MDR) проводили анализ межгенных взаимодействий, позволяющий выбрать одну из оптимальных моделей, которая обладает наибольшей точностью и минимальной ошибкой предсказания (X.Y. Lou и соавт., 2007) [13]. Различия считали статистически значимыми при уровне p<0,05.

Результаты

Распределение частоты выявления генотипов, включенных в исследование полиморфных вариантов генов, соответствовало распределению Харди—Вайнберга. Проведенный анализ ассоциаций полиморфных вариантов изучаемых генов с предрасположенностью к развитию ВПС у матерей, имеющих детей с пороками сердца, и у женщин, которые имели условно здоровых детей, не показал статистической значимости (табл. 1).

Таблица 1. Частота генотипов MTHFR (C677T), MTHFR (A1298C), MTR (A2756G), MTRR (A66G) у женщин, имеющих детей с врожденными пороками сердца

Примечание. ВПС — врожденный порок сердца. * — А.В. Цепокина и соавт., 2019 [12].

Выявлены 2 статистически значимые модели межгенных взаимодействий (табл. 2), которые ассоциированы с предрасположенностью к развитию ВПС. Модель А представлена сочетанием двух полиморфных вариантов генов MTHFR (C677T) и MTRR (A66G).

Таблица 2. Модели межгенного взаимодействия полиморфных локусов генов фолатного цикла, ассоциированных с предрасположенностью к развитию врожденных пороков сердца

Модель Б включала в себя сочетание всех четырех исследуемых полиморфных вариантов генов фолатного цикла.

Характер межгенных взаимодействий (синергизм, антагонизм и аддитивные взаимодействия) в модели Б представлен на рис. 1 на цв. вклейке.

Рис. 1. Диаграмма межгенных взаимодействий генов фолатного цикла, ассоциированных с предрасположенностью к развитию врожденных пороков сердца (ВПС).

Характер взаимодействия между полиморфными вариантами генов фолатного цикла характеризуется цветом линий: красный — выраженный синергизм, оранжевый — умеренный синергизм, синий — выраженный антогонизм, зеленый — умеренный антогонизм, коричневый — аддитивное взаимодействие.

Как видно из рис. 1, наибольший вклад в предрасположенность к развитию ВПС вносит ген MTHFR (A1298C) (1,91% энтропии), а также парные межгенные взаимодействия MTHFR (C677T) с MTRR (A66G) (1,31% энтропии). В то же время межгенные взаимодействия женских MTHFR (A1298C) с MTR (A2756G) вносят антогонистический вклад при формировании ВПС в последующем поколении со степенью энтропии 0,99%.

Анализ отдельных сочетаний генотипов исследуемых полиморфных вариантов генов фолатного цикла представлен на рис. 2.

Рис. 2. Особенности сочетаний генотипов исследуемых генов фолатного цикла у женщин основной и контрольной групп.

а — модель А; б — модель Б; темно-серые ячейки — сочетание генотипов высокого риска; светло-серые ячейки — протективные сочетания генотипов.

Для модели А (см. рис. 2, а) значимым в отношении высокого риска формирования ВПС в последующем поколении было сочетание двух гетерозиготных генотипов MTHFR (C677T)*C/T—MTRR (A66G)*A/G —OP 2,15 (95% ДИ 1,75; 4,96), p=0,01. Протективные сочетания женских генотипов исследуемых генов фолатного цикла в отношении формирования ВПС в последующем поколении не выявлены.

Для модели Б (см. рис. 2, б), также показано единственное значимое в отношении высокого риска формирования ВПС в последующем поколении сочетание четырех генотипов исследуемых генов фолатного цикла. Так, сочетание MTHFR (A1298C)*A/A—MTHFR (C677T)*C/T—MTRR (A66G)*A/G—MTR (A2756G)*A/A чаще встречалось у женщин основной группы, чем контрольной — OP 2,03 (95% ДИ 1,69; 5,12), p<0,05. Для модели Б, так же, как и для модели А, значимые протективные сочетания женских генотипов исследуемых генов фолатного цикла в отношении формирования ВПС в последующем поколении не выявлены.

Обсуждение

Исследование выполнено в группе женщин, имеющих детей с различными нозологическими формами ВПС. Удельный вес рождения детей со спорадическими ВПС без хромосомных синдромов и заболеваний составляет около 80% [14]. Именно прегравидарное прогнозирование риска формирования таких ВПС в последующем поколении имеет актуальное значение для современной профилактической медицины.

Доказано, что генотипы T/T и C/T MTHFR (C677T) ассоциированы с низкой средней удельной активностью фермента MTHFR и незначительной гомоцистеинемией [15]. Кроме того, авторами данного исследования показано, что аллели и генотипы полиморфного варианта гена MTHFR (A1298C) не связаны с активность кодируемого фермента. Незначительная гипергомоцистеинемия может лежать в патогенезе пороков развития плода [16, 17]. Показано, что сочетание снижения уровня фолата и увеличения уровня гомоцистеина в плазме крови и генотипов T/T и C/T MTHFR (C677T) у женщин, может являться фактором высокого риска формирования ВПС у их детей [16].

Полученные нами данные о синергетическом влиянии двух полиморфных вариантов генов MTHFR (C677T) и MTRR (A66G) согласуются с результатами мировых исследований. Так, китайские ученые установили, что в семейных парах, имеющих детей с ВПС различных фенотипов, аллель Т полиморфного варианта гена MTHFR (C677T) встречался чаще по сравнению с семейными парами, имеющих детей с дефектом межжелудочковой перегородки, в то время как аллель G полиморфного варианта гена MTRR (A66G) чаще встречался у родителей, чьи дети имели дефект межжелудочковой перегородки [2].

В исследовании, проведенном в 2006 г., также выявлено, что женщины с гомозиготным генотипом T/T MTHFR (C677T), не принимавшие фолиевую кислоту, имели более высокий риск рождения ребенка с ВПС. Кроме того, доказано трехкратное увеличение риска развития ВПС у потомства, если матери имели гетерозиготный генотип C/T MTHFR (C677T) и не принимали фолиевую кислоту [18]. Другая группа исследователей из Китая подтвердила гипотезу о том, что матери — носители гомозиготного генотипа T/T MTHFR (C677T) имеют более высокий риск рождения потомства с ВПС. Однако у отцов при проведении сравнительного анализа частоты выявления исследуемых генотипов статистически значимо не различались. Стоит отметить, что у детей, имеющих ВПС, гомозиготный генотип T/T MTHFR (C677T) также встречается чаще, чем у здоровых детей, что может свидетельствовать о его влиянии в отношении риска развития данной патологии [19].

Выявленная ассоциация сочетанных женских генотипов MTHFR (C677T)*C/T—MTRR (A66G)*A/G с ВПС у их детей является отправной точкой для разработки методов прегравидарной профилактики формирования спорадических ВПС в последующем поколении. В частности, у женщин с таким сочетанным генотипом необходим персонифицированный подход в выборе профилактических доз препаратов фолиевой кислоты и цианокобаламина (витамина B12). Подбор профилактических доз витаминов должен быть проведен с учетом содержания фолиевой кислоты, витамина B12 и их метаболитов в периферической крови женщин. О роли дефицита витамина B12 как фактора риска формирования ВПС неоднократно сообщалось в печати [20].

Заключение

Таким образом, исследование показало, что врожденные пороки сердца положительно ассоциированы с сочетанным генотипом MTHFR (C677T)*C/T—MTRR (A66G)*A/G полиморфных вариантов генов фолатного цикла. Кроме того, синергетическим действием в реализации формирования спорадических врожденных пороков сердца в последующем поколении обладают полиморфные варианты женских генов MTHFR (C677T) и MTRR (A66G), а антагонистическим — MTHFR (A1298C) и MTR (A2756G).

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Шабалдин А.В., Понасенко А.В.

Сбор и обработка материала — Синицкая А.В., Шмулевич С.А.

Статистический анализ данных — Синицкая А.В., Шмулевич С.А.

Написание текста — Шабалдин А.В.,

Редактирование — Шабалдин А.В., Понасенко А.В.

Финансирование. Работа выполнена при поддержке комплексной программы фундаментальных научных исследований СО РАН в рамках фундаментальной темы НИИ КПССЗ №0546-2019-0002 «Патогенетическое обоснование разработки имплантатов для сердечно-сосудистой хирургии на основе биосовместимых материалов, с реализацией пациент-ориентированного подхода с использованием математического моделирования, тканевой инженерии и геномных предикторов».

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.