Введение

Микроделеции длинного плеча Y-хромосомы (Yq), являющиеся частой генетической причиной тяжелых форм мужского бесплодия (МБ), впервые выявлены в 1976 г. Y-хромосома содержит гены, влияющие на формирование яичек, дифференцировку клеток Лейдига, Сертоли и других соматических клеток тестикулярной ткани, а также на развитие мужских половых клеток, тем самым непосредственно регулируя процесс сперматогенеза [1, 2]. Микроделеции локуса AZF (azoospermia factor) Y-хромосомы, приводящие к азооспермии и олигозооспермии, занимают второе место по частоте выявления после синдрома Клайнфельтера среди генетических причин МБ. Их обнаруживают примерно у 13% мужчин с необструктивной азооспермией и у 6—10% мужчин с тяжелой олигозооспермией [3—6].

По размерам и локализации микроделеций выделяют три неперекрывающихся субрегиона локуса «фактора азооспермии» AZF: AZFa, AZFb, и AZFc (см. рисунок на цв. вклейке) [7]. Микроделеции четвертого локуса AZFd, как правило, не сопровождаются клинически значимым влиянием на сперматогенез [8].

Схема Y-хромосомы, отображающая AZF-микроделеции.

а — схематическое изображение структуры псевдоаутосомной области (PAR1, PAR2), центромеры специфичной области мужской Y-хромосомы (male-specific region of the Y chromosome MSY) с восемью палиндромами (P1-P8), гетерохроматических последовательностей и тремя классами эухроматиновых последовательностей: X-транспонированной (отмечено голубым цветом), X-дегенерированной (коричневая полоска) и ампликлонами (белые полосы); b — карта-схема общих удалений AZF с соответствующими генами-кандидатами; c, d — STS сайты, связанные с локусами AZFa, b и c соответственно, по регионам, а также с группами генов в каждом из локусов (* — множественные копии) [7].

Schematic of the Y chromosome showing AZF microdeletions.

Регион AZFa охватывает примерно 800 тысяч пар нуклеотидов (т. п. н.) ДНК и содержит два гена: USP9Y, DBY(DDX3Y). При полной делеции региона AZFa с отсутствием генов USP9Y и DDX3Y развивается «синдром только клеток Сертоли» (Sertoli cell-only syndrome, SCOS) [9, 10].

Регион AZFb охватывает примерно 6 млн п. н. Делеции этого участка приводят к нарушению формирования первичных сперматоцитов вследствие блока сперматогенеза на допахитенных стадиях профазы I мейоза. Регион AZFb содержит 32 гена и частично перекрывается с регионом AZFc, в результате чего микроделеции AZFb нередко приводят также к утрате некоторых генов региона AZFc (например, DAZ1 и DAZ2) [10]. Участок AZFc занимает более 3,5 млн п.н. и содержит 23 гена из семи различных семейств: PRY, TTY, BPY, DAZ, GOLGA2LY, CSPYG4LY и CDY [11].

Согласно данным литературы, микроделеции наиболее часто возникают в субрегионе AZFc (65—70%), реже — в регионах AZFb, AZFb+c или AZFa+b+c (25—30%), а в субрегионе AZFa они встречаются только в 5% случаев МБ.

Накопилось немало сведений, свидетельствующих о наличии этнических различий в частоте выявления микроделеций и их фенотипических проявлений [11, 12]. В Армении, где МБ является не только медицинской, но и демографической и социально-экономической проблемой, ранее не исследовали распространенность и структуру микроделеций Y-хромосомы у мужчин с бесплодием.

Цель исследования — определить этнические особенности частоты и структуры микроделеционных изменений локуса AZF (azoospermia factor) у мужчин с бесплодием для оптимизации диагностических и лечебных мероприятий с применением вспомогательных репродуктивных технологий.

Материал и методы

В Центре медицинской генетики и первичной охраны здоровья (г. Ереван, Армения) проведено молекулярно-генетическое исследование на наличие микроделеций Y-хромосомы у 129 мужчин армянской национальности в возрасте от 18 лет до 51 года с азооспермией или олигозооспермией (<15 млн сперматозоидов в 1 мл).

Материалом исследования являлась периферическая кровь. Забор крови проводили из локтевой вены в специальные пробирки с EDTA для предотвращения свертывания крови и деградации ДНК. Согласно рекомендациям Европейской ассоциации андрологов (ЕАА) и программе внешнего контроля качества (https://www.emqn.org/emqn/), для выявления микроделеций Y-хромосомы применяли мультиплексный набор ПЦР, включающий 9 пар праймеров, позволяющий исследовать следующие Y-специфические маркеры: SRY (ген, определяющий мужской пол), ZFY (ген, кодирующий факторы транскрипции, содержащие мотивы «цинковых пальцев», обладающих ДНК-связывающей активностью), локусы sY84 (AZFa), sY86 (AZFa), sY615 (AZFa), sY127 (AZFb), sY134 (AZFb), sY254 (AZFc), sY255 (AZFc). Данная система позволяет определять от одного до нескольких фрагментов Y-хромосомы (в случае протяженной делеции), используя при этом другие фрагменты в качестве положительного контроля реакции в конкретном образце. Для выделения ДНК применяли набор «DNA-Blood» (Gentra® Puregene®). Все исследования проводились после информированного согласия пациентов.

Для статистического анализа полученных данных использовали пакет программ Origin 8.5. Коэффициент контингенции рассчитан для таблицы 4×4 для различных возрастных групп. Стандартную ошибку среднего возраста пациентов оценивали при уровне значимости p<0,05 [13].

Результаты и обсуждение

В результате молекулярно-генетического анализа у 13 (10,1%) из 129 пациентов с олиго/азооспермией выявлены микроделеции Y-хромосомы. Средний возраст мужчин с микроделециями составил 29 лет. Цитогенетическое исследование выполнено с целью выявления хромосомных нарушений у всех обследованных лиц. Таким образом, отобраны пациенты с нормальным кариотипом.

В данной группе, согласно результатам проведенного нами молекулярно-генетического анализа, в большинстве (69,2%) случаев обнаружена делеция одного из фрагментов, сопряженная с делецией соседнего участка.

Наиболее частыми оказались микроделеции региона AZFc (SY254, SY255) (табл. 1). При этом определенное число утраченных сайтов, а именно — SY84, SY86, SY127, SY134 напрямую влияют на степень выраженности олигозооспермии. Данные результаты согласуются с публикациями, согласно которым микроделеции субфрагмента AZFc являются наиболее частыми и составляют более 60% из всех встречаемых микроделеций [14]. Доля микроделеции региона AZFc в нашем исследовании составила 76,9%, AZFa — 38,5%, микроделеции AZFb выявлены в 30,8% случаев (см. табл. 1). Микроделеции SRY и ZFY региона IC pY обнаружены у одного пациента с азооспермией.

Таблица 1. Распределение микроделеций Y-хромосомы по типам

Как отмечалось выше, при микроделециях AZFc происходит утрата генов DAZ, кодирующих тестис-специфичные белки, необходимые для трансляции РНК в ходе мейоза, а также способствующих активации коактиваторов PGCα, PGCβ, необходимых в процессе эмбриогенеза. Частичная делеция региона AZFc с генами DAZ часто приводит к азооспермии и олигозооспермии (табл. 2). Другой ген региона AZFc — CDY, экспрессирующийся в зародышевых клетках, кодирует гистон-ацетилтрансферазу в ядрах сперматид, способствующую регуляции гиперацетилирования для образования протоамина в ядрах сперматид. Поэтому при утрате данного гена нарушается процесс дифференцировки сперматид в зрелые сперматозоиды [6, 12]. Представленный в нашем исследовании относительно высокий статистически значимый уровень полной делеции региона AZFc с удалением гена DAZ подтверждается данными, полученными в результате других исследований [12].

Таблица 2. Характеристика микроделеций Y-хромосомы в локусе AZF у обследованных пациентов

Выявленные в наших исследованиях делеции региона AZFa, как известно, приводят к утрате генов USP9Y и DBY (DDX3Y). Доказано, что ген USP9Y кодирует гидролазу и убиквитин-специфичную протеазу, связывающую убиквитин-белковые конъюгаты на уровне сперматидов [15]. Ген DBY кодирует РНК-хеликазу и экспрессируется в яичках, играет ключевую роль на ранних стадиях формирования сперматозоидов [16, 17]. Полная делеция данного региона Y-хромосомы является причиной развития SCOS, характеризующегося уменьшенным объемом (гипоплазией) яичек [6]. У одного из обследованных нами пациентов выявлены микроделеции, затрагивающие все локусы IC и AZFabc Y11-хромосомы. Подобный случай является крайне редким, указывающим фактически на SRY-негативную инверсию пола с мужским фенотипом. Согласно недавним исследованиям, полные делеции одновременно всех трех регионов AZF обнаруживают лишь в 10% случаев всех микроделеций длинного плеча Y-хромосомы, при этом у мужчин наблюдается первичное бесплодие, вызванное необструктивной азооспермией [11].

При микроделециях AZFb происходит утрата генов RBMY и PRY, кодирующих в эмбриональных клетках тестис-специфические РНК-связывающие белки, необходимые в процессе сплайсинга и регулирующие апоптоз [14, 18]. У мужчин с полными делециями AZFb и AZFb+c развивается необструктивная азооспермия.

Что касается этнических особенностей микроделеций Y-хромосомы, согласно данным иранских исследователей, среди курдского и тюркского населения Ирана превалирующей являлась микроделеция AZFb, однако, как полагают сами авторы, подобная частота выявления могла быть связана с различиями между этническими популяциями региона и является скорее исключением, нежели правилом в общем мониторинге микроделеций [16, 17]. Кроме того, в результатах исследований, проведенных иранскими коллегами, микроделеции маркеров SY84 и SY86 участка AZFa не выявлены ни в одном из случаев.

При сопоставлении полученных результатов с данными литературы о частоте выявления микроделеций Y-хромосомы в различных этнических группах, следует отметить также, что доля микроделеций AZF у мужчин армянской национальности с бесплодием достаточно высока — около 11%. Подобные показатели отмечены у жителей Азии, Мексики и Испании. Так, у арабов Туниса частота выявления всех типов микроделеций AZF составляла 11,8%, у фактически моноэтнического населения Японии — 11,7%, у жителей Испании и Мексики — 14 и 12%, соответственно [7, 19—22].

Заключение

Бесплодным семейным парам с мужским фактором бесплодия, а именно с наличием у мужчины микроделеции Y-хромосомы, целесообразно рекомендовать программу вспомогательных репродуктивных технологий — экстракорпоральное оплодотворение с инъекцией сперматозоида в цитоплазму яйцеклетки.

Поскольку все Y-несущие сперматозоиды, полученные у таких пациентов, содержат микроделеции, они обязательно будут передаваться их плодам мужского пола, что приведет впоследствии к таким же репродуктивным проблемам, связанным с Y-хромосомой. Кроме того, микроделеции регионов AZF (даже неполные) предрасполагают к нестабильности Y-хромосомы, поэтому могут рассматриваться как «премутации» с последующей полной делецией регионов Y-хромосомы, увеличивая риск появления эмбриональных клеток с хромосомным набором 45,X. У потомства, полученного с помощью экстракорпорального оплодотворения с инъекцией сперматозоида в цитоплазму яйцеклетки от многих носителей делеций региона AZFc, не обнаружены явные аномалии развития половых органов или другие соматические дефекты, вместе с тем обязательное медико-генетическое консультирование и преимплантационное генетическое тестирование помогут предотвратить рождение детей с хромосомными нарушениями, а также передачу наследственного дефекта потомкам мужчин с микроделециями Y-хромосомы.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.