Биохимические маркеры неразвивающейся беременности

Проблема сохранения репродуктивного резерва страны не теряет актуальности. Доказано, что даже при максимально благоприятных условиях жизни вероятность забеременеть в конкретном менструальном цикле не превышает 40%, остальные 60% приходятся на доклинические потери, связные с нарушением имплантационных и постимплантационных механизмов [1]. После отсеивания доклинических потерь шансы на прогрессирующую беременность возрастают до 80%. Таким образом, каждая 5-я беременность перестает развиваться в дальнейшем, причем подавляющее большинство (>80%) случаев неразвивающейся беременности приходится на ее I триместр [2—3].

Неразвивающаяся беременность (несостоявшийся выкидыш, замершая беременность) — это прекращение развития плодного яйца, гибель эмбриона или плода внутриутробно. На основании результатов ультразвукового исследования, несостоявшийся выкидыш принято делить на два типа: анэмбрионию (отсутствие эмбриона в плодном яйце) и гибель эмбриона/плода. Полный выкидыш (полный аборт) — это состояние, при котором выкидыш произошел полностью (плодное яйцо/эмбрион/плод полностью изгнаны из полости матки), нет необходимости в проведении медикаментозного или хирургического проведения опорожнения полости матки [4].

Центральным участником механизма формирования данных состояний являются протеолитические реакции организма, в том числе процессы аутолиза, происходящие в организме беременной благодаря ферментам лизосом — протеазам. Основными представителями протеаз являются катепсины — ферменты лизосом, участие которых в процессах менструального цикла, имплантации плодного яйца, эмбриогенеза доказано многими исследователями [5—8].

Цель исследования — изучить активность катепсина D в плазме крови при физиологической и неразвивающейся беременностях. Определить концентрации продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и карбонильных производных белков. На основе полученных данных доказать значение катепсина D как маркера патологии беременности и обосновать важность дальнейшего исследования данной темы для создания методики прогнозирования и своевременной диагностики неразвивающейся беременности.

В исследование включены 75 беременных, разделенные на 3 группы: первая группа (группа контроля) — 35 женщин с физиологически протекающей беременностью; во вторую и третью (основные) группы вошли 20 пациенток с неразвивающейся беременностью (гибель эмбриона/плода) и 20 пациенток с полным самопроизвольным абортом соответственно. По индексу массы тела, возрасту, соматическому, акушерско-гинекологическому анамнезам, количеству беременностей и родов группы не различались. Во всех представленных группах основную массу составляли первородящие: в контрольной — 72,8% и в основных группах — 67,5 и 63,7% соответственно. Самопроизвольных выкидышей в анамнезе у пациенток обеих групп не было. Доля хирургических абортов, выполненных по желанию пациенток, в основных группах составила 19,8 и 176%, в контрольной — 15,4%. Хронические заболевания составили 15,6, 13,7 и 17,1% в основных и контрольной группах соответственно.

Из кандидаток в группы исследования исключены пациентки с декомпенсированными формами заболеваний, инфекционными болезнями, аутоиммунными заболеваниями и не подписавшие информированное добровольное согласие. Проведение исследования одобрено этическим комитетом ФГБОУ ВО «РязГМУ» Минздрава России.

Диагноз «неразвивающаяся беременность» установлен по результатам биохимического и инструментального исследований. Основанием для установления диагнозов полного аборта и неразвивающейся беременности являлись низкий уровень хорионического гонадотропина человека (ХГЧ), не соответствующий сроку беременности, а также данные ультразвукового исследования органов малого таза (трансабдомиального или трансвагинального).

Ультразвуковое исследование с допплерометрией проводили в сроке беременности 8—12 нед. Критериями установления диагноза в данном случае являлись отсутствие сердцебиения у эмбриона/плода, не соответствующие сроку гестации размеры эмбриона/плода, деформация плодного яйца, отсутствие эмбриона в плодном яйце [9, 10].

Ультразвуковое исследование, определение уровня ХГЧ и взятие образцов крови производились на двух базах: ГБУ РО «Городская клиническая больница №8» и ГБУ РО «Городской клинический родильный дом №1». Дальнейший анализ образцов крови и определение активности протеаз проводились на базе кафедры биологической химии ФГБОУ ВО «РязГМУ» Минздрава России.

Материалом исследования являлась венозная кровь пациенток. Образцы получали сразу после подтверждения диагноза неразвивающейся беременности. Кровь брали в 2 вакуумные пробирки APEXLAB с ЭДТА-К3 6 мл и 4 мл натощак. Вакуумные пробирки помещали в медицинский штатив для пробирок и в термоконтейнере ТМ-8 в течение 1 ч доставляли на кафедру.

Концентрацию белка определяли с помощью коммерческого набора (ООО «ГК Эко-сервис», Россия) по методу Лоури. Концентрацию продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) определяли фотометрическим методом по реакции с тиобарбитуровой кислотой и путем дальнейшей экстракции бутанолом (ООО «Агат-Мед», Россия), выражали в мкмоль/мг белка. Уровень карбонильных производных белков определяли по методу R. Levine, концентрацию рассчитывали с использованием коэффициента молярной экстинкции εмМ = 22 мМ^–1·см^–1. В последующем производили расчет в нмоль/мг белка.

В определении активности катепсина D использован фотометрический метод, основанный на спектрофотометрическом определении кислоторастворимых продуктов ферментативного гидролиза гемоглобина. Активность выражали в нмоль тирозина/мин/мг белка.

При статистическом анализе данных, полученных в ходе исследования, использовали программу Statistica 10.0. Проверка нормальности распределения данных осуществлялась с использованием критерия Шапиро—Уилка (W-критерий). Результаты представлены в формате Me [Q1; Q3], где Me — медиана, Q1 — первый квартиль (25%), Q3 — третий квартиль (75%). Для анализа статистической значимости различий независимых выборок использовали ранговый критерий Манна—Уитни (U-тест). Критический уровень статистической значимости различий нулевой гипотезы (p) принимали равным 0,05.

Активность катепсина D статистически значимо возрастала на 33,1% (p=0,004) у пациенток с замершей беременностью по сравнению с показателями у женщин контрольной группы (физиологическая беременность) и не изменялась при аборте (см. рисунок).

Активность катепсина D в плазме крови (нмоль тирозина/мин на 1 мг белка) у пациенток исследуемых групп.

* — разница статистически значимая по сравнению с группой физиологической беременности.

Plasma cathepsin D activity (nmol tyrosine/min mg protein) in the control group and study groups.

Концентрация продуктов ПОЛ увеличивалась у пациенток групп аборта и замершей беременности на 49,6% (p=0,03) и 98,5% (p=0,01) соответственно по сравнению с женщинами группы физиологической беременности. Концентрация карбонильных производных белков не изменялась у пациенток группы аборта и повышалась у женщин с замершей беременностью на 34,1 (p=0,04) по сравнению с исследуемыми группы физиологической беременности (см. таблицу).

Оценка окислительного стресса в плазме крови обследованных женщин

Assessment of oxidative stress in blood plasma in the control group and study groups

Примечание. * — разница статистически значимая по сравнению с группой физиологической беременности.

Повышение активности катепсина D связано с протеолитическими процессами аутолиза и стремлением организма беременной расщепить или изгнать из полости матки чужеродный, ставший патологическим для организма агент — плодное яйцо без эмбриона при анэмбрионии, нежизнеспособный/прекративший свое развитие эмбрион/плод.

Карбонильные производные белков образуются в результате прямого взаимодействия активных форм кислорода с белками или ПОЛ с белками, поэтому при аборте (кратковременный процесс) липиды не успевают взаимодействовать с белками, и уровень карбонильных производных белков не изменяется. При замершей беременности (длительный процесс) наблюдается увеличение содержания карбонильных производных белков, которые формируются, возможно, за счет взаимодействия с липидами.

В процессе проведения исследования выяснены причины повышения активности катепсина D, повышения концентрации продуктов перекисного окисления липидов и карбонильных производных белков при полном самопроизвольном аборте и гибели эмбриона/плода. Доказана роль катепсина D в качестве маркера неразвивающейся беременности. Обоснована важность дальнейшего исследования для создания методики прогнозирования и своевременной диагностики неразвивающейся беременности.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Кошулько П.А., Коваленко М.С.

Сбор и обработка материала — Абаленихина Ю.В., Миров А.И., Голофаст О.Е.

Статистический анализ данных — Рокунов Е.Д.

Написание текста — Кошулько П.А.

Редактирование — Кошулько П.А., Коваленко М.С.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.