Основной функцией фолликулов яичника в преовуляторную фазу женского репродуктивного цикла является стабильное пополнение резерва годных к оплодотворению ооцитов. Зрелый фолликул содержит в себе ооцит, окруженный слоем гранулезных клеток, который, в свою очередь, окружен васкуляризированным слоем клеток теки. Гранулезные клетки секретируют в полость фолликула фолликулярную жидкость (ФЖ) [1], которая имеет важное значение в процессах роста фолликулов, созревания ооцита и овуляции [2]. ФЖ формируется из компонентов плазмы и растворимых факторов, секретируемых резидентными и гранулезными клетками, необходимых для поддержания и регуляции фолликулогенеза [3]. Биохимический состав ФЖ и плазмы крови схож и включает в себя белки, липиды, факторы роста и гормоны [4—6]. Гранулезные клетки — это неваскуляризированный слой, окружающий фолликул, поэтому принято считать, что именно они секретируют наибольшую часть белковых компонентов в ФЖ [1]. Среди разнообразия функций белков, растворенных в ФЖ, менее изученной является функция прокоагулянтных и антикоагулянтных компонентов системы гемостаза [7, 8]. ФЖ содержит внеклеточные везикулы (ВВ), с которыми могут быть ассоциированы различные белковые факторы [9, 10]. ВВ, локализованные в разных тканях и жидкостях организма, участвуют в регуляции большого количества процессов, в том числе свертывания крови [11]. Наличие на поверхности ВВ тканевого фактора (ТФ) и фосфатидилсерина (ФС) запускает каскад свертывания как при физиологических, так и при патологических процессах [12—15]. Гепарансульфаты в высокой концентрации содержатся в ФЖ. Помимо мощного антикоагуляционного эффекта они участвуют в ремоделировании тканей путем активации антитромбина и взаимодействия с эффекторными белками [8].
Во время овуляции при достижении фолликулом определенного размера и функциональной активности происходит его разрыв, и яйцеклетка покидает фолликул. В норме это повреждение тканей яичника происходит ежемесячно со своевременным запуском регенерации ткани [16]. Но при патологии яичника или системы гемостаза возможны кровотечения, сопровождающиеся воспалительным процессом [17, 18].
Известно, что в менструальном цикле и при некоторых заболеваниях, например, при апоплексии яичника, кровотечения прекращаются самопроизвольно [19]. Вероятно, факторы свертывания, гепарансульфаты и ВВ обеспечивают своевременную остановку кровотечения.
Цель исследования — анализ содержания факторов свертывания крови и ВВ в ФЖ и оценка их вклада в процессы коагуляционного гемостаза.
ФЖ получали от женщин (=15), обратившихся в ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России для лечения бесплодия методами вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Все пациентки подписали информированное добровольное согласие. Перед началом лечения бесплодия с применением методов ВРТ проведено клинико-лабораторное обследование супружеских пар в соответствии с приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации от 23 августа 2012 г. №107н «О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению».
Стимуляция функции яичников у всех пациенток проводилась по стандартному протоколу с антагонистами гонадотропин-рилизинг-гормона (антГнРГ) в комбинации с рекомбинантным фолликулостимулирующим гормоном (рФСГ). Протокол овариальной стимуляции начинался со 2—3-го дня менструального цикла (т.е. в раннюю фолликулярную фазу). Доза препаратов рФСГ подбиралась индивидуально от 150 МЕ до 300 МЕ в зависимости от клинико-лабораторных показателей. Динамика роста фолликулов оценивалась с помощью ультразвукового (УЗ) мониторинга. С целью предотвращения паразитарного пика эндогенного лютеинизирующего гормона (ЛГ) при достижении диаметра фолликулов 14—15 мм начинали введение препарата антГнРг в дозе 0,25 мг/сут подкожно.
С целью финального дозревания ооцитов в качестве триггера овуляции при достижении диаметра фолликулов 18 мм вводили препарат хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) в дозе 5—10 тыс. ЕД/сут за 35—36 часов до планируемой трансвагинальной пункции яичников.
Аспирация ооцитов производилась спустя 35—36 ч после инъекции препарата ХГЧ под кратковременным внутривенным наркозом посредством вакуумной аспирации под трансвагинальным УЗ-контролем с использованием одноразовых игл (Vitrolife Inc., США). Аспират помещали в подогретые стерильные пробирки и незамедлительно передавали эмбриологу для выявления ооцит—кумулюсного комплекса и оценки степени зрелости полученных ооцитов. Оставшуюся ФЖ собирали в стерильные пробирки объемом 14 мл (Corning, USA). Для анализа использовали ФЖ без примеси крови.
Для выделения везикул из ФЖ использовали метод дифференциального центрифугирования [20]. Образец объемом 5 мл последовательно центрифугировали для удаления дебриса (400 g в течение 10 мин и 10 000 g при 4 °С в течение 30 мин). Супернатант использовали для выделения везикул ультрацентрифугированием при 108 000 g, затем осадок ресуспендировали в 100 мкл фильтрованного и предварительно центрифугированного (108 000 g) фосфатно-солевого буфера (ФБС). Образцы ВВ хранили при –80 °С.
В образцах ФЖ определяли концентрацию фибриногена по Клауссу, содержание факторов свертывания крови V, VII, X, XII, тромбиновое время, анти-Ха активность, уровни протеина С и антитромбина III — с использованием реагентов HemosIL (Instrumentation Laboratory, Италия): QFA Thrombin, Factor V Deficient Plasma, Factor VII, Factor Х Deficient Plasma, Factor ХII, Liquid Anti-Xa, Protein С, Liquid Antithrombin. Исследования проводили на автоматическом коагулометре ACL TOP 700 (IL Werfen, США).
Прокоагулянтную активность ТФ, ассоциированного с ВВ, измеряли с помощью тест-системы ИФА ZYMUPHEN MP-TF kit (HYPHEN BioMed, Франция). Предварительные данные показали, что содержание ТФ в исходной суспензии ВВ превышает верхний порог чувствительности теста, в связи с чем производили серию разведений 1:10, 1:100, 1:1000. Измерения оптической плотности производили на микропланшетном ридере Infinite f50 (TECAN GROUP LTD., Швейцария) при длине волны 405 нм. Концентрацию ТФ определяли по построенной калибровочной кривой.
Материалом для гемостазиологических исследований служила венозная кровь 6 здоровых доноров после получения письменного согласия. Забор крови проводили натощак из локтевой вены после 15-минутного отдыха с соблюдением правил взятия крови в пробирки SARSTEDT Monovette, содержащие 3,2% раствор цитрата натрия в соотношении 1:9. Следует отметить, что, согласно правилам преаналитики, первую порцию крови никогда не использовали, так как содержащийся в ней ТФ мог повлиять на полученные результаты. Учитывая относительную нестабильность отдельных факторов свертывания, все исследования выполняли в течение часа. Бестромбоцитарную плазму (БТП) получали двухэтапным центрифугированием c помощью центрифуги СМ-6 (ELMI, Латвия) при 1500 g в течение 20 мин и при 13000 g — 5 мин.
Тромбоэластометрия — графическая регистрация изменения вязко-упругих свойств образца цельной крови при образовании сгустка. Методом тромбоэластометрии оценивали кинетику образования сгустка и его прочность в режиме реального времени с помощью анализатора Rotem delta (Tem Innovations GmbH, Германия). С целью нейтрализации цитрата натрия в образец добавляли хлорид кальция (star-TEM (0,2 М CaCl). Эксперименты проводили с помощью тестов NATEM и EXTEM. Для оценки общего пути свертывания (NATEM) не использовали активатор. Для оценки внешнего пути коагуляции (EXTEM) в роли активатора выступал ТФ.
В ходе эксперимента к 1 мл цельной крови добавляли 100 мкл ФБС (контроль) или 100 мкл ВВ, кровь аккуратно пипетировали. Образец помещали в кювету с цилиндрическим стержнем (Cup&Pin pro). Программное обеспечение ROTEMстроило кривую зависимости прочности сгустка от времени — ТЕМограмму. Для анализа нативной ФЖ (тест EXTEM) использовали 300 мкл ФЖ, предварительно центрифугированной при 3000 g в течение 3 мин для осаждения дебриса и клеточных элементов. Оценивали следующие хронометрические параметры: время свертывания (CT) и время образования сгустка (CFT).
Для изучения роли фосфатидилсерина в прокоагулянтных эффектах ВВ инкубировали с аннексином V (Sony Biotechnology, США) для маскирования поверхностного фосфатидилсерина. ВВ выделяли методом дифференциального центрифугирования из 5 мл ФЖ и ресуспендировали в 90 мкл специализированного буфера с добавлением 10 мкл реагента аннексин V и инкубировали 30 мин при комнатной температуре, после чего полученную суспензию добавляли к 1 мл цельной крови и проводили тест NATEM.
Нами предпринята попытка нейтрализовать гепарин в нативной ФЖ с помощью реагента HEPTEM («Tem Innovations GmbH», Германия). HEPTEM — лиофилизат: гепариназа I, выделенная из флавобактерий в буфере c CaCl, — способный нейтрализовать высокое количество нефракционированного (до 7 ЕД/мл) и умеренное — низкомолекулярного гепарина. Для этого к 300 мкл ФЖ добавляли HEPTEM 20 мкл, инкубировали 15 мин при температуре 37 °C.
Тест «Тромбодинамика» (ТД) с помощью видеомикроскопии позволяет регистрировать распространение фибринового сгустка в образце (без смешивания) от имитированной поврежденной сосудистой стенки (вставка-активатор с ТФ). Скорость роста в пространстве указывает на общий прокоагулянтный потенциал, тогда как формирование не зависящих от активатора центров самопроизвольного свертывания крови (спонтанные сгустки) свидетельствует о наличии собственных прокоагулянтных компонентов — микровезикул, активных факторов свертывания, следов ТФ. ТД проводили с помощью регистратора тромбодинамики (ООО «ГемаКор», Россия) согласно ранее описанному протоколу [21]. Беcтромбоцитарную плазму (БТП), полученную из 1 мл цельной крови, смешивали с 100 мкл ВВ или с равным объемом ФБС. На основании автоматически полученных профилей определены следующие параметры роста сгустков: время спонтанного образования сгустков — время, необходимое для заполнения 5% площади кюветы; общее время образования сгустков — время, необходимое для заполнения 100% площади кюветы; скорость образования фибринового сгустка. Производили также анализ способности нативной ФЖ образовывать фибриновые сгустки в данной тест-системе.
Статистический анализ проводили с помощью программы Statistica 10.0 для Windows (StatSoft Inc., USA). Данные представлены в виде среднего и стандартного отклонения от среднего. Проверку однородности дисперсии проводили с помощью теста Левина. Для сравнения двух независимых групп данных вычисляли -критерий Стьюдента, для сравнения большего числа групп данных применяли параметрический дисперсионный анализ (ANOVA). Различия между статистическими величинами считались статистически значимыми при <0,05.
Все коммерческие тест-системы для оценки плазменного гемостаза, за исключением АЧТВ и анти-Ха активности, считаются нечувствительными к гепарину за счет наличия в их составе нейтрализатора гепарина — полибрена. Однако полибрен способен ингибировать гепарин до 1 ЕД/мл. В связи с тем, что в образцах ФЖ выявлена высокая анти-Ха активность более 1 ЕД/мл , образцы ФЖ обрабатывали гепариназой. Но полного снижения анти-Ха активности в образцах в ФЖ не наблюдалось. Этот феномен может объясняться высоким содержанием 3-О-сульфатированного гепарансульфата (более 50% от общего уровня гепарансульфата в ФЖ), который обладает антикоагулянтными свойствами [8] и способен ингибировать гепариназу [22]. В пробах с гепариназой и без нее статистически значимых различий уровней фибриногена и фактора VII не выявлено . Поэтому дальнейший анализ содержания факторов в ФЖ проводили без учета значений анти-Ха активности. Таким образом, образцы ФЖ с высоким значением анти-Ха активности не исключались из исследований.
* — нормативные значения для плазмы крови, указанные в таблице, представлены производителем тест-систем IL Werfen (США).
В ФЖ обнаружены XII, VII, X и V факторы свертывания крови, а также естественные антикоагулянты: антитромбин III и протеин С . Следует отметить, что уровень факторов свертывания X, XII и VII и антитромбина III соответствовал их содержанию в крови, а уровень фактора V и его ингибитора протеина С оказались значительно ниже. Концентрация общего кальция в ФЖ составила 2,1 ммоль/л, что соответствует значению показателя в плазме крови . Наличие факторов «внешнего пути» свертывания (X, VII, V), кальция и активатора коагуляции (ТФ) должно вести к образованию тромбина, под воздействием которого фибриноген трансформируется в фибрин-мономер с формированием сгустка [7, 23]. Однако в тесте не зарегистрировано тромбиновое время формирования сгустка при активации коагуляции тромбином (данные не представлены). Как показано ранее, в фолликулярной жидкости здоровых женщин образование нитей фибрина не происходит [24].
* — нормативные значения для плазмы крови, указанные в таблице, представлены производителем тест-систем IL Werfen (США).
Прокоагулянтные свойства ВВ ФЖ анализировали с помощью метода тромбоэластометрии ROTEM. ВВ, выделенные из 5 мл ФЖ, добавляли к образцам цельной крови для имитации процессов кровотечения, возникающих при овуляции . ТЕМограммы отражали гиперкоагуляционные эффекты после добавления ВВ . Резко сократилось время до начала формирования сгустка (CT) — уменьшилось в 3,2 раза, с 1350±149 до 427±36 с и время формирования сгустка (CFT) — в 2,7 раз, с 508±67 до 183±17 с .
Репрезентативная диаграмма тромбоэластометрии влияния внеклеточных везикул фолликулярной жидкости на свертываемость крови в присутствии и в отсутствие аннексина-V (а); CT — время свертывания (б); CFT — время образования сгустка (в); * — статистические значимые различия между группами «контроль» и «везикулы»; — статистические значимые различия между группами «везикулы» и «везикулы + аннексин» (≤0,05).
Representative thromboelastometry diagram of follicular fluid EVs influence on blood coagulation in the presence or absence of annexin-V (a). CT — clotting time (b); CFT — clot formation time (с); * — stands for statistically significant differences between «control» and «vesicle» groups; — stands for statistically significant differences between «vesicles» and «vesicles + annexin» groups, ≤0.05.
Известно, что наличие ФС на внешней поверхности мембраны клеток, а также на поверхности ВВ способствует процессам коагуляции [14, 25]. Для выявления ФС на поверхности ВВ и оценки их роли в качестве активатора коагуляции мы добавляли к препаратам ВВ, выделенных из ФЖ, аннексин V, который маскирует ФС. Затем ВВ с аннексином V добавляли к образцам крови, в результате чего время свертывания и время образования сгустка статистически значимо увеличилось в среднем на 15% для CT и на 30% для CFT по сравнению с нативными ВВ , что указывает на присутствие в препарате ВВ фракции везикул, несущих на своей поверхности ФС.
Кроме того, мы исследовали влияние ВВ на процессы коагуляции с помощью теста тромбодинамики. Добавление к контрольной БТП (здоровые доноры) ВВ ФЖ, ресупендированных в 100 мкл ФБС, приводило к появлению спонтанных очаговых сгустков по всему объему кюветы уже на 7±2,2 мин эксперимента , тогда как в контрольной группе спонтанные сгустки не наблюдались. ВВ ФЖ также способствовали формированию фибринового сгустка во всем объеме кюветы на 12-й минуте эксперимента, тогда как в контрольных образцах без ВВ в конечной точке наблюдения (30 мин) площадь сгустка занимала в среднем 20±0,3% от общей площади кюветы, а его формирование проходило строго в зоне пластинки с ТФ . Помимо этого в образцах с ВВ скорость образования фибринового сгустка увеличилась почти в 2 раза, с 29,7±2,5 мкм/мин до 54±6,1 мкм/мин . Полученные результаты демонстрируют выраженную прокоагулянтную активность не только в цельной крови, но и в БТП.
Репрезентативные изображения спонтанного тромбообразования (а) и фибринового сгустка (в); время появления спонтанных сгустков (б). Площадь занимаемого сгустка на 30-й минуте (г). Скорость образования сгустка (д); * — ≤0,05 по сравнению с контрольной группой.
Representative screenshots of thrombodynamics videos showing spontaneous clot formation (a) and fibrin clot (c). Spontaneous clot formation time (b). Area occupied by a clot at the end of assay (30 min) (d). Rate of clot formation (e). * — ≤0,05 in comparison to control group.
Мы предположили, что помимо фосфатидилсерина, ВВ ФЖ могут нести на своей поверхности достаточное количество ТФ, чтобы инициировать прокоагулянтные процессы. В наших предварительных результатах измерения содержания ТФ на поверхности ВВ, выделенных из 5 мл ФЖ, получены значения оптической плотности, превышающие допустимые для точного определения данным методом, что свидетельствовало о высоком количестве ТФ в ВВ. При разведении 1:100 и пересчете на неразведенный образец, содержание ТФ на поверхности ВВ ФЖ составило в среднем 1600 пг/мл. Известно, что содержание ТФ на поверхности микровезикул в БТП здоровых рожениц, а также пациенток с глубоким инфильтративным эндометриозом составляет 1 пг/мл; содержание ТФ на поверхности ВВ ФЖ в значительной степени превосходит данные показатели [26].
Таким образом, ФЖ содержит ВВ, с которыми ассоциированы фосфатидилсерин и ТФ. И такие ВВ обладают значительной прокоагулянтной активностью.
В ходе исследования мы обнаружили, что формирования фибринового сгустка в ФЖ при активации ТФ не происходит, несмотря на наличие факторов свертывания крови V, X, XII, VII и кальция. Ранее показано, что в ФЖ может происходить незначительное образование тромбина для процессов коагуляции [7], вероятно, связанное с низкой активностью фактора V (в 10 раз ниже по сравнению с плазмой крови) и, как следствие, недостаточным количеством «протромбиназы», состоящей из активированного фактора X, связанного с ним фактора V, кальция и фосфолипидов. В то же время сниженное содержание протеина С может быть обусловлено фактическим отсутствием субстратов фактора Vа и фактора VIII. Таким образом, количество тромбина в ФЖ намного ниже, чем в плазме крови, и не достигает уровня, необходимого для образования сгустка. Кроме того, сгустки в ФЖ не образуются из-за наличия высокого уровня естественного антикоагулянта антитромбина III, равного содержанию в крови, и высокого уровня гепаринов, многократно увеличивающих активность антитромбина III. Остается неясной роль достаточно высокой активности фактора XII в ФЖ, несмотря на то что возможность запуска коагуляции по внутреннему пути уже ограничена отсутствием субстрата — фактора VIII.
В ФЖ выявлен отличный от плазмы крови баланс между прокоагулянтной (ВВ, несущие на своей поверхности активаторы свертывания (ТФ, ФС)) и антикоагулянтной (гепарансульфат) системой, направленной не на образование фибринового сгустка, а на осуществление биологической функции ее компонентами.
В ФЖ мы также обнаружили два типа ВВ: ассоциированные с ТФ (ВВ-ТФ) и фосфатидилсерином (ВВ-ФС), которые при добавлении к образцам цельной крови или БТП крови активируют процессы свертывания.
Несмотря на выраженный прокоагуляционный потенциал ВВ, методами ротационной тромбоэластометрии (EXTEM) и тромбодинамики не зарегистрировано формирование сгустка в нативной ФЖ при активации коагуляции ТФ. P.A. Gentry и соавт. показали, что добавление в ФЖ ТФ извне инициирует процесс образования тромбина, однако скорость его образования и суммарное количество гораздо ниже, чем в плазме крови млекопитающих [7]. Такие различия авторы объясняют существованием лишь одного внешнего пути свертывания крови, а также присутствием в ФЖ ингибиторов свертывания крови — антитромбина III, α2-макроглобулина и гепарансульфатов [3, 8]. Тем не менее с физиологической точки зрения, наличие только компонентов внешнего пути свертывания оправдано, так как образование нитей фибрина в полости фолликула сделало бы невозможным нормальный обмен растворимыми факторами между ооцитом, самой ФЖ и гранулезными клетками, что привело бы к отклонениям в развитии ооцитов. Вероятно, основное назначение системы свертывания крови в ФЖ — это продукция небольшого количества тромбина для осуществления сигнальной функции [27]. Установлено, что тромбин, помимо своей роли в гемостазе, активно участвует в регуляции клеточной физиологии, включающей пролиферацию, реконструкцию клеточного матрикса, хемотаксис и секрецию цитокинов [27], а также играет важную роль в созревании ооцитов [26].
Данные предположения верны с точки зрения физиологического развития фолликула до стадии овуляции. Однако при созревании ооцита или патологии яичника происходит разрыв ткани фолликула и выход яйцеклетки наружу. Таким образом, система свертывания в ФЖ в виде ВВ, ассоциированных с ФС и ТФ, инициирующих процесс свертывания, обеспечивает остановку кровотечения. Для проверки этой гипотезы мы добавляли ВВ в образцы цельной крови или БТП и оценивали процесс тромбообразования. ВВ обладали значительной прокоагулянтной активностью и ассоциировались с большим количеством ТФ (1600 пг/мл). Вероятно, такое избыточное количество ТФ на поверхности ВВ ФЖ играет важную роль в процессах коагуляции при повреждении яичника.
Полученные нами данные позволяют утверждать, что везикулы фолликулярной жидкости обладают выраженными прокоагулянтными свойствами. В фолликулярной жидкости выявлен баланс между прокоагулянтной системой, представленной внутриклеточными везикулами, несущими на своей поверхности активаторы свертывания (тканевый фактор и фосфатидилсерин), и антикоагулянтной системой, представленной антитромбином III и гепаринами. Данный баланс, в отличие от плазмы крови, направлен не на образование фибринового сгустка, а на осуществление регуляторной функции ее компонентами.
Концепция и дизайн исследования — Г.С., Е.К., Д.С., О.Б., Н.Д.
Сбор и обработка материала — Е.К., Д.С., О.Б., К.Г., Ю.Ш., А.Х., Н.М., А.П.
Статистическая обработка — Д.С.
Написание текста — Е.К., Д.С., О.Б., К.Г., А.Х., Л.К.
Редактирование — Г.С., Д.С., Л.К, Т.И., Е.К., Н.Д.