Показатели функциональной зрелости сперматозоидов при первичной оценке эякулята

С внедрением вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) в повседневную практику лечения бесплодия супружеских пар семиологический анализ стал стандартным начальным исследованием для мужчины. Спермограмма позволяет оценить многие количественные характеристики эякулята, но не дает ответа о функциональной зрелости сперматозоидов. Поиск новых физиологических методов определения зрелости привел к появлению HBA-теста (Sperm-Hyaluronan Binding Assay, анализ на связывание спермиев с гиалуроновой кислотой, или гиалуронаном) и внедрению его в рутинную практику эмбриологической лаборатории.

НВА-тест основан на том же принципе, что и селекция сперматозоидов при естественном оплодотворении, достигающих ооцитарно-кумулюсного комплекса (ОКК) в ампулярном отделе маточной трубы. Известно, что в фаллопиевой трубе гиперактивированные сперматозоиды преодолевают главный компонент экстрацеллюлярного матрикса ОКК — линейный полисахарид гиалуронан и достигают прозрачной оболочки [1—3]. Гиалуронан не только удерживает клетки лучистого венца вместе, формируя лабиринтную систему [4], но и играет решающую роль в селекции сперматозоидов [5]. Пенетрация внеклеточного матрикса становится возможной, так как гиперактивированные сперматозоиды несут на своей плазмолемме поверхностную гиалуронидазу к гиалуронану. Эти рецепторы, названные SPAM1 [sperm adhesion molecule 1 (PH-20 hyaluronidase, zona pellucida binding)], приобретаются мембраной клетки на терминальных этапах спермиогенеза [6—8].

SPAM1 — одноцепочечный гликопротеин с гликозилфосфатидилинозитольной областью, благодаря которой этот белок крепится к плазматической мембране сперматозоида. Помимо якорной области, в SPAM1 имеются функциональные домены. Нейтральный каталитический домен осуществляет гиалуронидазную активность в отношении кумулюсного матрикса при нейтральном значении pH [9—11]. В условиях акросомной реакции, когда акросома сливается с плазмолеммой спермия и высвобождает свое содержимое, растворимую форму гиалуронидазы, активируется еще и кислотный каталитический домен SPAM1, обеспечивающий гиалуронидазную активность в zona pellucida и перивителлиновом пространстве, облегчая пенетрацию [12—14]. Регуляторным звеном в работе SPAM1 является HSPA2 (heatshockproteinA2). Этот белок теплового шока А2, относящийся к классу шаперонов, обеспечивает изменение конфигурации и экспрессии молекул SPAM1 в процессе капацитации. HSPA2 регулирует экспрессию SPAM1 на поверхности сперматозоида таким образом, что при проникновении через кумулюсный матрикс экспрессия SPAM1 максимальна [15—18].

На сегодняшний день наличие рецепторов к гиалуронану на поверхности мужской половой клетки рассматривается как отличительный признак зрелого сперматозоида. Именно поэтому использование теста на связывание сперматозоидов с гиалуроновой кислотой (HBA-тест) позволяет провести быструю и неинвазивную оценку функциональной зрелости сперматозоидов вне зависимости от семиологического анализа.

1. Оценить результаты НВА-теста у пациентов с нормозооспермией и патозооспермией.

2. Установить наличие или отсутствие связи между значениями НВА-теста и основными показателями семиологического анализа: концентрацией, подвижностью и морфологией сперматозоидов.

3. Выявить возможные предикторные критерии спермограммы для проведения НВА-теста.

Проведена стандартная спермограмма и HBA-тест в день сдачи эякулята у 102 пациентов, проходивших лечение в отделении ВРТ ФГБУ ЭНЦ в период с января 2014 г. по январь 2016 г. Семиологическое исследование выполнялось согласно руководству ВОЗ 2010 г., а HBA-тест, согласно рекомендациям производителя (ORIGIO, Дания). Статистическую обработку данных в сравниваемых группах проводили с помощью корреляционного анализа и t-критерия Стьюдента.

По результатам спермограммы пациенты были разделены на две группы: 1-я группа (54 пациента) — нормозооспермия, 2-я группа (48) — патозооспермия. В каждой группе оценивалась связываемость сперматозоидов с гиалуронаном с помощью HBA-теста.

Средний возраст мужчин в 1-й и 2-й группах составил 34,6±1,1 и 34,2±0,87 года соответственно. Среднее количество сперматозоидов в 1 мл эякулята — 76,7±7,26 и 32,3±6,39 млн соответственно, подвижность сперматозоидов — 54,7±1,78 и 32,4±4,00%. При анализе значений HBA-теста в сравниваемых группах были получены статистически значимые различия — 73,3±3,04 и 61,4±4,79% соответственно (р≤0,05).

Эти данные согласуются с результатами исследований последних лет. Установлено, что по крайней мере три гиалуронансвязывающих белка вовлечены в созревание и подвижность сперматозоида, его гиалуронидазную активность и связывание с zona pellucida, акросомную реакцию [7, 9]. Отмечено, что процент клеток с нормальной морфологией, хорошей конденсацией хроматина и способностью связываться с прозрачной оболочкой выше во фракции сперматозоидов, способных преодолевать кумулюс [19]. У гиалуронансвязывающих сперматозоидов каспаза-3, маркер апоптоза и фрагментации ДНК, не обнаруживается. Однако наиболее существенным является снижение частоты хромосомных анеуплоидий у гиалуронансвязывающих сперматозоидов по сравнению с гиалуронаннесвязывающими сперматозоидами [5]. По-видимому, существует корреляция между высоким уровнем активности мембранных рецепторов, имеющих гиалуронидазную активность, и существенной экспрессией белков теплового шока, которые обеспечивают транспорт ферментов репарации ДНК для снижения ее повреждения.

Наши данные указывают на значительное снижение уровня HBA в группе с патозооспермией, что может косвенно свидетельствовать о нарушениях процессов ремоделирования рецепторного аппарата сперматозоидов, увеличения уровня фрагментации ДНК и анеуплоидий.

Таким образом, согласно полученным данным, рекомендовано проведение HBA-теста пациентам с патозооспермией для исключения возможных рисков при проведении программы ВРТ.

В настоящее время данные литературы о корреляции между показателями семиологического анализа и значением HBA-теста малочисленны и противоречивы.

Поскольку НВА-тест не является скрининговым тестом перед вступлением пары в программу ЭКО/ИКСИ, то перед нами стояла задача определить возможные предикторные значения спермограммы, когда НВА-тест может быть рекомендован для проведения.

По результатам НВА-теста пациенты были разделены на несколько групп. К 1-й группе были отнесены пациенты, у которых связывание с гиалуронаном было >85% и <85%. Следующие 7 групп имели значения НВА-теста по нисходящей на 5% (табл. 1, 2, 3). Последняя группа со значениями >50% и <50% была рубежной в нашем исследовании. Это обусловлено малым количеством пациентов со значениями НВА-теста существенно <50% и невозможностью проведения статистического анализа.

Анализ концентрации сперматозоидов в группах с различным значением НВА-теста показал статистически значимые различия (р≤0,05, р≤0,01) концентрации сперматозоидов в 1 мл нативного эякулята (см. табл. 1). Разница в содержании сперматозоидов в группе была от 35,5 до 49,4%. На рис. 1 отмечается последовательное снижение значений как НВА-теста c 85 до <65%, так и концентрации сперматозоидов c 54 до 41 млн/мл. Дальнейшее снижение значений НВА-теста не приводило к заметному уменьшению концентрации сперматозоидов. Коэффициент корреляции (r) был равен 0,325 (при t=3,03; р≤0,05). Исходя из поставленной задачи нашего исследования, возможным предикторным значением для назначения НВА-теста является концентрация сперматозоидов ≤41 млн/мл.

Сравнение результатов подвижности сперматозоидов с данными НВА-теста в группах исследования демонстрирует статистически значимые различия (р≤0,05, р≤0,01); минимальная разница значений по подвижности в группе составила 17,5%, а максимальная — 30,6% (см. табл. 2). На рис. 2 отмечается последовательное снижение значений НВА-теста с 85 до <70% и содержания прогрессивно подвижных сперматозоидов с 44 до 38%. Далее на рис. 2 отмечается плато со статистически незначимым подъемом. Степень связи между подвижностью и величиной связывания с гиалуронаном был 0,332 (при t=3,1; р≤0,05). При прогрессивной подвижности сперматозоидов ≤38%, по нашим данным, рекомендуется выполнение НВА-теста.

Морфологический анализ сперматозоидов в группах с различным значением НВА-теста показал статистически значимые различия (р≤0,05, р≤0,01) в группах сравнения (см. табл. 3). Разница значений в группе колебалась от 32,1 до 60,6%. На рис. 3 очевидно снижение значений как НВА-теста с 85 до <70%, так и содержания морфологически нормальных сперматозоидов с 5 до 3%. Рис. 2 показывает, что, начиная со значения НВА-теста <70% не происходит дальнейшего снижения значений морфологически нормальных сперматозоидов, а r=0,332 (при t=2,66; р≤0,05). Таким образом, возможным предикторным значением для выполнения НВА-теста является содержание морфологически нормальных сперматозоидов ≤3%.

Таким образом, наши данные демонстрируют умеренную статистически достоверную положительную корреляцию между значениями НВА-теста и основными показателями спермограммы: концентрацией, подвижностью и морфологией. Сходные закономерности опубликованы в работе [20, 21].

Согласно результатам исследования, предикторными значениями спермограммы для проведения НВА-теста являются концентрация ≤41 млн/мл, подвижность ≤38%, морфология ≤3%. Назначение дополнительного анализа на связывание с гиалуронаном тем пациентам, у которых значения спермограммы равны или ниже предикторных показателей, возможно, поможет выявить пациентов с плохим репродуктивным прогнозом и увеличить количество благоприятных клинических исходов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликтаинтересов.

Информация об источнике финансирования: ФГБУ «Эндокринологический научный центр» Минздрава России.