Программированная гибель половой клетки — апоптоз — многоступенчатый процесс, имеющий характерное сочетание морфологических и биохимических признаков, которые позволяют диагностировать данный вид гибели клеток [1—3]. Физиологическая сущность апоптоза проявляется изменениями как в ядре и цитоплазме, так и в клеточной мембране сперматозоида и имеет свои особенности, связанные с организацией ДНК и половой клетки в целом: специфический характер организации хроматина, отсутствие транскрипционной активности и очень малый объем цитоплазмы [4—6].

Эти изменения носят следующий характер: в ядре имеет место конденсация хроматина и последующая его фрагментация, что выявляется при помощи методов TUNEL, Comet assay и SCSA; в цитоплазме происходит снижение трансмембранного потенциала митохондрий (∆ψm); изменение в клеточной мембране включает повышение ее проницаемости для небольших молекул, например йодида пропидия (PI). Вследствие реорганизации клеточной мембраны на ее поверхность начинают экспрессироваться некоторые молекулы, чего в норме не происходит, например, фосфатидилсерин (ФС) [2, 7—9].

Одно из самых ранних биохимических изменений, происходящих в клетке, подвергшейся апоптозу, это нарушение симметрии клеточной мембраны и перемещение ФС на ее внешнюю сторону (экстернализация). Поэтому Ф.С. — фосфолипид, который в процессе апоптоза локализуется на клеточной поверхности и формирует один из специфических сигналов для распознавания апоптотической клетки [10, 11].

Белком, способным связываться с ФС и детектировать его экстернализацию на поверхность мембраны сперматозоидов при апоптозе, является аннексин-V (AnV). Живые клетки не связывают AnV и непроницаемы для катионного красителя PI [(AnV–/PI–)-сперматозоиды]. Потеря мембранной асимметрии в динамике развития апоптоза соответствует начальным этапам фрагментации ДНК и конденсации хроматина (ранний апоптоз) и предшествует потере проницаемости мембраны для PI. На этой стадии апоптотические клетки связывают AnV, но, как и живые клетки, непроницаемы для PI [(AnV+/PI–)-сперматозоиды]. Поздняя фаза апоптоза, формирование апоптозных телец, сопровождается не только формированием мембранной асимметрии, но и резким возрастанием проницаемости мембраны для PI. Клетки, находящиеся в позднем апоптозе, и частично некротические клетки связывают AnV и проницаемы для PI [(AnV+/PI+)-сперматозоиды]. Некротические клетки не связывают AnV, но проницаемы для PI [(AnV–/PI+)-сперматозоиды] [2, 8].

Известно, что у мужчин с различными параметрами спермограммы в среднем 20% эякуляторных сперматозоидов имеют признаки апоптоза, по данным как «аннексинового» метода, так и TUNEL метода. Причем исследования, в которых проводился анализ с использованием AnV и методов детекции разрывов в ДНК, таких как TUNEL, доказывают наличие корреляции между экстернализацией ФС и разрывами в ДНК в сперматозоидах [2, 4, 12].

Некоторыми исследователями [13, 14] сделаны попытки выявить связь между наличием признаков апоптоза у эякуляторных сперматозоидов и нарушениями параметров спермы (концентрацией, подвижностью и морфологией сперматозоидов). Однако эти данные носят довольно противоречивый характер, что диктует необходимость расширения работы в этом направлении [5].

Цель нашего исследования — выявить взаимосвязь между нарушением симметрии клеточной мембраны и перемещением ФС на ее внешнюю сторону и функционально-морфологическими нарушениями сперматозоидов у мужчин, состоящих длительное время в бесплодном браке.

В исследовании приняли участие 78 субфертильных мужчин, состоящих в бесплодном браке, и 18 фертильных мужчин. Средний возраст всех обследованных составил 33,5±1,0 года. От всех мужчин было получено информативное согласие на проведение исследований.

Сбор эякулятов проводился после 72 ч сексуального воздержания. Каждый эякулят после разжижения был разделен на две части: одна часть для анализа стандартной спермограммы, другая — для выявления экстернализации ФС.

Измерение показателей стандартной спермограммы (объем, вязкость, время разжижения эякулята, концентрация, подвижность, жизнеспособность и морфология сперматозоидов) проводили в соответствии с рекомендациями и нормативами ВОЗ [15, 16], согласно которым все эякуляты были разделены на фертильные и субфертильные.

Фертильными считали эякуляты, содержащие более 20·10⁶ сперматозоидов в 1 мл; более 50% живых и подвижных; более 14% с нормальной морфологией по «строгим критериям» Kruger—Menkveld [17].

Для выявления экстернализации ФС сперматозоиды выделяли из образцов эякулятов методом отмывания от семенной плазмы фосфатно-солевым буфером pH 7,4 и инкубировали при 37 °C в течение 10 мин с АnV-FITC и PI («Becton Dickinson»), согласно инструкции изготовителя. Мазки исследовались на флюоресцентном микроскопе под иммерсионным объективом ×100 [2, 8].

При статистической обработке полученных данных о достоверности различий судили по величине t-критерия Стьюдента. Различия между показателями считали достоверными при значении р<0,05. Оценка взаимосвязи исследуемых показателей осуществлялась подсчетом коэффициента корреляции (r) Пирсона.

В результате проведенного исследования в эякулятах всех обследованных мужчин были идентифицированы два вида АnV-связывающих сперматозоидов: (AnV+/PI–) и (AnV+/PI+)-сперматозоиды, что соответствовало ранней и поздней стадиям апоптоза соответственно. Среди свежевыделенных сперматозоидов здоровых доноров общее число таких клеток с экстернализацией ФС составило в среднем 16%.

У субфертильных мужчин около 40% сперматозоидов оказались АnV+, из них 17,8% (АnV+/PI–)-клеток, т. е. с признаками раннего апоптоза, и 21,6% (АnV+/PI+)-клеток (в позднем апоптозе). Эти результаты были вполне сопоставимы с данными ранних исследований при использовании подобного подхода [4, 5, 10].

Причем выявлено, что процентное содержание в эякулятах (АnV+/PI–) — и (AnV+/PI+) — сперматозоидов коррелировало между собой (r=0,47; p<0,01).

Анализ корреляции между содержанием в эякулятах субфертильных мужчин АnV-позитивных сперматозоидов и традиционными параметрами спермы дал следующие результаты: не обнаружено статистически достоверной корреляции с физико-химическими показателями эякулята — объемом, вязкостью и временем разжижения. Не было обнаружено корреляции между содержанием в эякуляте (АnV+/PI–)-клеток и функционально-морфологическими характеристиками сперматозоидов. При этом выявлена достоверная положительная корреляция между количеством (AnV+/PI+)-сперматозоидов и концентрацией сперматозоидов (r=0,49; р<0,001); подвижность сперматозоидов отрицательно коррелировала с содержанием в эякуляте (АnV+/PI+)-клеток (r=–0,37; р<0,001); отмечена положительная корреляция между количеством (АnV+/PI+)-клеток и содержанием в эякуляте атипичных сперматозоидов (r=0,3; p<0,01).

Полученные результаты о корреляции (AnV+/PI+)-сперматозоидов субфертильных мужчин с концентрацией, подвижностью и дефектами морфологии сперматозоидов демонстрируют, что нарушение симметрии клеточной мембраны и перемещение ФС на ее внешнюю сторону оказывает неблагоприятное воздействие на качество спермы.

Однако отсутствие взаимосвязи между содержанием в эякуляте (АnV+/PI–)-сперматозоидов, находящихся на ранних стадиях апоптоза, и основными параметрами спермы согласуется с данными о том, что качество спермы затрагивается только на последней стадии апоптоза [13, 18], когда происходит не только изменение архитектоники клеточной мембраны, но и фрагментация ДНК.

Выявленная положительная корреляция (AnV+/PI+)-клеток с концентрацией сперматозоидов противоречит некоторым ранним сообщениям [4]. Противоречивые результаты о связи концентрации сперматозоидов и апоптозе можно расценить как проявление, в некоторых случаях, организмом компенсаторной реакции усиления сперматогенеза в ответ на увеличение доли дефектных сперматозоидов.

Наблюдаемая экстернализация ФС, вероятно, произошла еще в период сперматогенеза во время апоптического процесса, и АnV+ сперматозоиды, выявленные нами, как раз те клетки, которые должны были быть устранены в сперматогенезе в процессе апоптоза, но избежали этого процесса, так как по каким-то причинам механизмы апоптоза не были закончены, либо были отложены, либо функционировали неправильно — неполный апоптоз или «абортивний апоптоз» [12, 19—21].

Таким образом, показана взаимосвязь между нарушением архитектоники клеточной мембраны, сопровождающимся перемещением ФС на ее внешнюю сторону, и функционально-морфологическими нарушениями сперматозоидов у бесплодных мужчин, что позволяет считать нарушение симметрии клеточной мембраны и экстернализацию ФС фактором, снижающим фертильность спермы.

Клинически, традиционных показателей спермограммы не всегда достаточно в оценке мужской фертильности [22, 23]. Поэтому сделана попытка использовать некоторые структурно-биохимические изменения, происходящие вне ядерного аппарата сперматозоидов, характерные для апоптоза, для расширения доказательной базы некоторых параметров спермы.

Полученные данные могут представлять интерес при выявлении причин нарушения мужской фертильности и для диагностики репродуктивного здоровья мужчин.